Закономерности дифференцировки стволовых клеток
Межклеточные контакты, положение клеток в эмбрионе, воздействие разнообразных факторов роста и дифференцировки совместно дерепрессируют каскад генов, направляющих формирование развивающегося зародыша. Несмотря на значительный прогресс в понимании молекулярных механизмов морфогенеза, очевидно, что многие гены, управляющие развитием, до сих пор не идентифицированы и на основные вопросы, касающиеся специфичности отдельных линий, ответы не получены.
Дифференциация, регулируемая агрегацией (эмбриональные тельца). Мутации многих из экспрессирующихся генов приводят к летальному фенотипу на стадии гаструляции или несколько позже. В лабораторных условиях исследовали эмбриональных стволовые клетки, содержащие меченый ген, чтобы определить, требуется ли мутировавший ген для образования ткани определенного типа.
Многие исследования по изучению роли факторов, продуцируемых примитивной эндодермой, были основаны на изучении дифференциации эмбриональных стволовых клеток в культуре суспензии, где внешний слой смешанной висцеральной и пристеночной энтодермы окружен большим количеством дифференцирующихся клеток.
Через несколько дней культивирования эти скопления клеток именуются эмбриональными тельцами, из-за большого количества эмбриональных производных на ранних стадиях развития. Они окружены слоем эндодермы, содержащей маркеры висцеральной эндодермы α-фетопротеин, апикально локализующийся и др.). В последующем внутри эмбрионального тельца образуется полость, напоминающая амниотическую.
В определенной степени эмбриональные тельца действительно напоминают эмбрион на раннем этапе развития с внешним слоем энтодермы и внутренней примитивной эктодермой, из которых дифференцируется мезенхима и другие производные. Внутри эмбрионального тельца гистологически или с использованием клеточно-специфических антител можно определить несколько типов клеток.
Благодаря росту эмбриональные стволовые клетки эмбриональные тельца образуют сливающиеся культуры после удаления LIF из культуральной среды, когда эмбриональные стволовые клетки культивируются в чашках Петри в необработанной культуральной среде или в условиях слабого взаимодействия с субстратом (например, в культуре с метилцеллюлозой). Такие культуральные условия обычно приводят к образованию больших неравномерных скоплений клеток. Более точный контроль осуществляется при помещении известного количества клеток (500-1000) в культуры висящей капли.
Хорошие результаты наблюдали при выращивании эмбриональных стволовых клеток в культуре ткани, которой придавалась способность низкого сцепления путем воздействия УФ-света на связи белкового покрытия на поверхности чашки Петри с культурой. Через 18-24 ч после УФ-воздействия на культуры с поверхности чашки прорастали одинаковые эмбриональные тельца. Этот метод можно также использовать для создания специальных субстратов с областями высокого и низкого сцепления.
Эмбриональные тельца выращивались также с добавлением в среду ретиноевой кислоты или в среде, содержащей сыворотку, или с дополнительными факторами роста для ускорения дифференцировки. Исследовать эмбриональные тельца можно в различные временные промежутки для определения типов имеющихся в них клеток. Их можно выращивать даже для получения чистых линий клеток.
Эмбриональные тельца — удобный объект в процессе изучения апоптоза и кавитации, в морфогенезе эпителия и в изучении роли специфических генов энтодермы. Если в результате нулевой мутации произошла дородовая смерть вследствие плейотропного действия гена, эмбриональные тельца показывают значимость этого гена для дифференциации определенной линии клеток.
Модель изучения экспрессии того или иного гена при дифференциации эмбриональных телец обычно напоминает ту, которая наблюдается в живом организме в ранние сроки после имплантации с последующей экспрессией генов в зависимости от слоя клеток зародыша. Однако дифференцировка клеток в центре конгломерата, одни из которых дифференцируются, некоторые проходят процесс апоптоза, и все они выделяют сигнальные молекулы, мало похожа на четкие волны дифференцировки, которые формируются в цельном зародыше. Несмотря на смешение факторов роста и смерти, нормальные и атипичные контакты клеток, внутренняя часть скопления, очевидно, хорошо насыщается кислородом. Однако в другом исследовании отдельные простые эмбриональные тельца продуцировали в 3, 5 раза больше дифференцированных производных (нестин + предшественники клеток центральной нервной системы).
Когда дифференцировавшие клетки были удалены из эмбриональных телец путем трансфекции эмбриональные стволовые клетки для экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы под контролем ограниченного стволовыми клетками промотора Oct3/4 при высоких уровнях антибиотиков, внешний слой висцеральной эндодермы и дифференцирующие клетки внутри эмбриональных телец были удалены. Наблюдалось увеличение количества плюрипотентных стволовых клеток в условиях, которые при других обстоятельствах усилили бы их дифференцировку (LIF). На основании этих результатов предполагается, что дифференцирующиеся клетки, в частности, висцеральной эндодермы могут отвечать за инициацию дифференцировки в эмбриональные тельца.
Хотя эмбриональные тельца были полезной моделью развития, тестом на потенциал дифференцировки после мутации критического гена и дали популяцию, обогащенную определенной клеточной линией, дифференцирующие клетки должны быть каким — либо образом отделены до изучения экспрессии генов из пула РНК перед имплантацией, поскольку продолжающееся размножение стволовых клеток, присутствующих в центре агрегата, может привести к образованию опухоли.