Закономерности дифференцировки стволовых клеток

Межклеточные контакты, положение клеток в эмбрионе, воздействие разнооб­разных факторов роста и дифференцировки совместно дерепрессируют каскад ге­нов, направляющих формирование развивающегося зародыша. Несмотря на зна­чительный прогресс в понимании молекулярных механизмов морфогенеза, очевид­но, что многие гены, управляющие развитием, до сих пор не идентифицированы и на основные вопросы, касающиеся специфичности отдельных линий, ответы не получены.

Дифференциация, регулируемая агрегацией (эмбриональные тельца). Мутации многих из экспрессирующихся генов приводят к летальному фенотипу на стадии гаструляции или несколько позже. В лабораторных условиях исследовали эмбриональных стволовые клетки, содержащие меченый ген, чтобы определить, требуется ли мутировавший ген для образования ткани определенного типа.

Многие исследования по изучению роли факторов, продуцируемых примитив­ной эндодермой, были основаны на изучении дифференциации эмбриональных стволовых клеток в культуре суспензии, где внешний слой смешанной висцеральной и пристеночной энтодер­мы окружен большим количеством дифференцирующихся клеток.

Через несколько дней культивирования эти скопления клеток именуются эм­бриональными тельцами, из-за большого количества эмбриональных производных на ранних стадиях развития. Они окружены слоем эндодермы, содержащей мар­керы висцеральной эндодермы α-фетопротеин, апикально локализующийся и др.). В последующем внутри эмбрионального тельца образуется полость, напоминающая амниотическую.

В определенной степени эмбриональные тельца действительно напоминают эмбрион на раннем эта­пе развития с внешним слоем энтодермы и внутренней примитивной эктодермой, из которых дифференцируется мезенхима и другие производные. Внутри эмбрионального тельца ги­стологически или с использованием клеточно-специфических антител можно оп­ределить несколько типов клеток.

Благодаря росту эмбриональные стволовые клетки эмбриональные тельца образуют сливающиеся культу­ры после удаления LIF из культуральной среды, когда эмбриональные стволовые клетки культивируются в чашках Петри в необработанной культуральной среде или в условиях слабого взаимодействия с субстратом (например, в культуре с метилцеллюлозой). Такие культуральные условия обычно приводят к образованию больших неравномерных скоплений клеток. Более точный контроль осуществляется при помещении изве­стного количества клеток (500-1000) в культуры висящей капли.

Хорошие ре­зультаты наблюдали при выращивании эмбриональных стволовых клеток в культуре ткани, которой придава­лась способность низкого сцепления путем воздействия УФ-света на связи бел­кового покрытия на поверхности чашки Петри с культурой. Через 18-24 ч после УФ-воздействия на культуры с поверхности чашки прорастали одинаковые эмбриональные тельца. Этот метод можно также использовать для создания специальных субстратов с об­ластями высокого и низкого сцепления.

Эмбриональные тельца выращивались также с добавлением в среду ретиноевой кислоты или в среде, содержащей сыворотку, или с дополнительными фак­торами роста для ускорения дифференцировки. Исследовать эмбриональные тельца можно в различ­ные временные промежутки для определения типов имеющихся в них клеток. Их можно выращивать даже для получения чистых линий клеток.

Эмбриональные тельца — удобный объект в процессе изучения апоптоза и кавитации, в морфоге­незе эпителия и в изучении роли специфических генов энтодермы. Если в резуль­тате нулевой мутации произошла дородовая смерть вследствие плейотропного дей­ствия гена, эмбриональные тельца показывают значимость этого гена для дифференциации определен­ной линии клеток.

Модель изучения экспрессии того или иного гена при дифференциации эмбриональных телец обычно напоминает ту, которая наблюдается в живом организме в ранние сроки после имплантации с последующей экспрессией генов в зависимости от слоя кле­ток зародыша. Однако дифференцировка клеток в центре конгломерата, одни из которых дифференцируются, некоторые проходят процесс апоптоза, и все они вы­деляют сигнальные молекулы, мало похожа на четкие волны дифференцировки, которые формируются в цельном зародыше. Несмотря на смешение факторов ро­ста и смерти, нормальные и атипичные контакты клеток, внутренняя часть скоп­ления, очевидно, хорошо насыщается кислородом. Однако в другом исследовании отдельные простые эмбриональные тельца продуцировали в 3, 5 раза больше дифференцированных производных (нестин + предшественники клеток центральной нервной системы).

Когда дифференцировавшие клетки были удалены из эмбриональных телец путем трансфекции эмбриональные стволовые клетки для экспрессии гена неомицинфосфотрансферазы под контролем ограничен­ного стволовыми клетками промотора Oct3/4 при высоких уровнях антибиоти­ков, внешний слой висцеральной эндодермы и дифференцирующие клетки внут­ри эмбриональных телец были удалены. Наблюдалось увеличение количества плюрипотентных ство­ловых клеток в условиях, которые при других обстоятельствах усилили бы их дифференцировку (LIF). На основании этих результатов предполагается, что дифференцирующиеся клетки, в частности, висцеральной эндодермы могут отвечать за инициацию дифференцировки в эмбриональные тельца.

Хотя эмбриональные тельца были полезной моделью развития, тестом на потенциал дифференци­ровки после мутации критического гена и дали популяцию, обогащенную опре­деленной клеточной линией, дифференцирующие клетки должны быть каким — либо образом отделены до изучения экспрессии генов из пула РНК перед имплан­тацией, поскольку продолжающееся размножение стволовых клеток, присутству­ющих в центре агрегата, может привести к образованию опухоли.