Трансплантация производных эмбриональных стволовых клеток
Несмотря на то, что взрослые стволовые клетки, похоже, не имеют полной сигнальной системы, направленной на дифференцировку эмбриональные стволовые клетки в сайтспецифические клеточные фенотипы, необходимо трансплантировать производные эмбриональных стволовых клеток новорожденным и взрослым.
Производные эмбриональных стволовых клеток получают при случайной дифференцировке и последующей селекции In vitro, а также в некоторых случаях путем направления дифференцировки эмбриональных стволовых клеток In vitro в более ограниченную по потенциальным возможностям группу стволовых клеток, которые могут дифференцироваться по определенному пути в ответ на сохранившиеся сигналы, поддерживаемые интактными или поврежденными взрослыми тканями.
В нескольких экспериментах использовали производные эмбриональные стволовые клетки для коррекции дефицита тканей. Так, в результате случайной дифференцировки были получены кардиомиоциты из эмбриональных тел мышей. Их вводили в мышцу желудочка mdx мышей с дистрофией. Трансплантат стабильно включался в сердечную мышцу хозяина, что доказано методом антидистрофинового окрашивания.
Мультипотентные глиальные клетки-предшественники, полученные путем направленной дифференцировки мышиных эмбриональных стволовых клеток In vitro, вводили в спинной и головной мозг 7-дневной мутантной крысы с дефицитом миелина. Мутация копирует болезнь Polizaeus-Merzbacher. Тесты на протеолипидный белок, сателлитную ДНК мыши и GFAP показали, что введенные клетки дифференцируются в астроциты и олигодендроциты, которые ремиелинизируют аксоны спинного и головного мозга. Сходные результаты были получены после трансплантации полученных из эмбриональных стволовых клеток предшественников олигодендроцитов в спинной мозг shiverer — мышей с отсутствием миелина — или в задние канатики взрослых крыс с химическим поражением спинного мозга.
Мультипотентные предшественники нейронов, полученные путем направленной дифференцировки эмбриональной карциномы мышей In vitro и введенные в поврежденные участки спинного мозга крыс, приводящих к параличам, на 9-й день после повреждения мигрировали из поврежденного участка и дифференцировались в нейроны, астроциты и олигодендроциты. В течение месяца крысы были в состоянии поднимать лапы и демонстрировали неловкие шагающие движения передними конечностями, хотя полного функционального выздоровления достигнуто не было.
Остается неясным: восстанавливали ли трансплантированные клетки некоторые функции путем формирования новых соединений нейронов, ремиелинизацией аксонов хозяина, секрецией факторов, усиливающих регенерацию хозяина или какой-либо комбинацией этих факторов?
Одно из важных направлений клеточной терапии — лечение печеночной недостаточности, вызванной различными причинами. К настоящему времени накоплен большой экспериментальный и клинический опыт в решении этой проблемы. Одним из кардинальных способов ее решения является использование стволовых клеток печени, которые, сохраняя способность к пролиферации, могут превращаться в специализированные клетки. При этом используются три типа клеток:
· эмбриональные стволовые клетки печени, которые в зависимости от условий культивирования могут превращаться в гепатоциты или клетки желчных ходов (эмбриональные стволовые клетки);
· зрелые гепатоциты, к которым может вернуться способность пролиферировать;
· овальные клетки (клетки печени непаренхиматозного происхождения с выраженной способностью к пролиферации).
Стволовые клетки желчных ходов возникают из клеток эндодермы, образующих печеночный дивертикул — зачаток, появляющийся на 22-й день эмбрионального развития на брюшной стороне передней эндодермы зародыша человека. Эмбриональные стволовые клетки образуют трабекулы, заселяя мезенхиму поперечной перегородки. Они обнаруживаются в печени эмбриона человека с конца 4-й недели (у крыс с 10-12-го дня). Они пролиферируют и дифференцируются либо в гепатоциты, либо в клетки желчных протоков. На этом этапе еще сохраняется дифференцировка. Гепатобласты могут давать начало клеткам протоков, а из последних образуются овальные клетки — недифференцированные клетки, из которых могут формироваться гепатоциты, клетки желчных ходов и клетки других органов (энтероциты, клетки поджелудочной железы).
Стволовые клетки желчных ходов можно изолировать из эмбриональной печени в конце 2-й недели эмбриогенеза крыс или мышей и культивировать In vitro. В зависимости от условий культивирования эмбриональные стволовые клетки печени могут дифференцироваться в гепатоциты или клетки желчных ходов, которые отличаются по ультраструктуре и характерным маркером (альбумин, альфа-фетопротеин, цитокератины 1 и 18 в гепатоцитах и гамма-глутамилтрансфераза — в клетках протоков).
В клетках эндодермы еще до дифференцировки их в эмбриональные стволовые клетки печени экспрессируется ядерный фактор 3 гепатоцитов (фактор роста гепатоцитов 3) — один из наиболее ранних транскрипционных факторов, обнаруженных в печеночном дивертикуле. Вероятно, этот белок регулирует формирование эндодермы и дифференцировку клеток печени, так как экспрессируется раньше других белков, модулирующих транскрипцию.
Эмбриональные стволовые клетки, используемые для лечения печеночной недостаточности, можно изолировать из эмбриональной печени при прерывании беременности по медицинским показаниям, хотя в таких случаях возникают проблемы этического характера. Кроме того, по ряду важных признаков эмбриональные гепатоциты отличаются от зрелых гепатоцитов: глюконеогенез в печени человека начинается лишь на 4-й месяц эмбрионального развития, полярность эпителия гепатоцитов у крыс исчезает через несколько недель после рождения, эмбриональная печень экспрессирует альфа-фетопротеин, а не альбумин. Таким образом, гепатоциты эмбриональной печени способны пролиферировать, но функцию печени заменить не могут. Предпринимались попытки лечения молниеносной печеночной недостаточности эмбриональными гепатоцитами, которые вводили больным в брюшную полость, но безуспешно.
Обнадеживающие результаты дали исследования по предварительной изоляции эмбриональной карциномы печени человека, их культивирования и дифференцировки In vitro. Клетки-предшественники из эмбриональной печени 14-дневного зародыша крысы изолировали и вводили взрослым животным. Эти клетки заселяли пораженную печень животных, формировали печеночные трабекулы и желчные протоки. Такие результаты дают возможность найти перспективную альтернативу пересадке печени.
Зрелые гепатоциты делятся крайне медленно. В норме в печени только 0, 1-0, 01 % Клеток находятся в состоянии митоза. Частота митозов значительно увеличивается при регенерации печени, например, после частичной гепатэктомии у крыс. В этом случае накопление клеток идет за счет деления зрелых дифференцированных гепатоцитов. Зрелые гепатоциты способны воспроизводить только себе подобных потомков.
Введение нормальных взрослых гепатоцитов в печень трансгенных мышей с тяжелым поражением печени обеспечивает почти полное заселение пораженного органа. Взрослые гепатоциты при этом сохраняли способность к пролиферации. Клетки делились до 77 раз, что сопоставимо с пролиферативной способностью кроветворные стволовые клетки. Успешные результаты были получены и в случае введения взрослых гепатоцитов крысам с приобретенными поражениями печени. Пересаженные клетки контактируют с гепатоцитами хозяина по всей дольке печени, а также с клетками желчных ходов. Они морфологически и функционально сохраняют свойства нормальных взрослых гепатоцитов и не превращаются в протоковые или опухолевые клетки.
В ходе этих исследований возник вопрос о том, все ли гепатоциты обладают способностью к пролиферации. При фракционировании клеток было установлено, что гепатоциты среднего и крупного размера склонны к пролиферации. Они локализуются в медиальной и центральной частях печеночной дольки, мелкие — вокруг перипортального пространства. Из-за этой локализации мелких гепатоцитов некоторые исследователи считают их стволовыми клетками печени. Однако в экспериментах по регенерации после частичного удаления печени установлено, что в пролиферации участвуют все гепатоциты, независимо от месторасположения в дольке.
Необходимы дальнейшие исследования по изучению факторов, индуцирующих пролиферацию. Известно, что важная роль принадлежит факторам роста. Так, у мышей постоянная перфузия фактора роста гепатоцитов ведет к увеличению массы печени, пролиферации гепатоцитов, увеличению продолжительности жизни гепатоцитов, несущих экзогенные конструкции. Через 1 неделю после введения ретрозина крысам почти все гепатоциты этих животных заменили донорскими клетками.