Трансплантация производных эмбриональных стволовых клеток

Несмотря на то, что взрослые стволовые клетки, похоже, не имеют полной сиг­нальной системы, направленной на дифференцировку эмбриональные стволовые клетки в сайтспецифические клеточные фенотипы, необходимо трансплантировать производные эмбриональных стволовых клеток новорож­денным и взрослым.
Производные эмбриональных стволовых клеток получают при случайной дифференцировке и последующей селекции In vitro, а также в некоторых случаях путем направления дифференци­ровки эмбриональных стволовых клеток In vitro в более ограниченную по потенциальным возможностям груп­пу стволовых клеток, которые могут дифференцироваться по определенному пути в ответ на сохранившиеся сигналы, поддерживаемые интактными или поврежден­ными взрослыми тканями.

В нескольких экспериментах использовали производные эмбриональные стволовые клетки для коррекции дефицита тканей. Так, в результате случайной дифференцировки были получе­ны кардиомиоциты из эмбриональных тел мышей. Их вводили в мышцу желу­дочка mdx мышей с дистрофией. Трансплантат стабильно включался в сердечную мышцу хозяина, что доказано методом антидистрофинового окрашивания.

Мультипотентные глиальные клетки-предшественники, полученные путем на­правленной дифференцировки мышиных эмбриональных стволовых клеток In vitro, вводили в спинной и го­ловной мозг 7-дневной мутантной крысы с дефицитом миелина. Мутация копи­рует болезнь Polizaeus-Merzbacher. Тесты на протеолипидный белок, сателлитную ДНК мыши и GFAP показали, что введенные клетки дифференцируются в астроциты и олигодендроциты, которые ремиелинизируют аксоны спинного и голов­ного мозга. Сходные результаты были получены после трансплантации получен­ных из эмбриональных стволовых клеток предшественников олигодендроцитов в спинной мозг shiverer — мы­шей с отсутствием миелина — или в задние канатики взрослых крыс с химичес­ким поражением спинного мозга.

Мультипотентные предшественники нейронов, полученные путем направленной дифференцировки эмбриональной карциномы мышей In vitro и введен­ные в поврежденные участки спинного мозга крыс, приводящих к параличам, на 9-й день после повреждения мигрировали из поврежденного участка и дифферен­цировались в нейроны, астроциты и олигодендроциты. В течение месяца крысы были в состоянии поднимать лапы и демонстрировали неловкие шагающие дви­жения передними конечностями, хотя полного функционального выздоровления достигнуто не было.

Остается неясным: восстанавливали ли трансплантированные клетки некоторые функции путем формирования новых соединений нейронов, ремиелинизацией аксонов хозяина, секрецией факторов, усиливающих регенерацию хозяина или какой-либо комбинацией этих факторов?

Одно из важных направлений клеточной терапии — лечение печеночной недо­статочности, вызванной различными причинами. К настоящему времени накоп­лен большой экспериментальный и клинический опыт в решении этой пробле­мы. Одним из кардинальных способов ее решения является использование ство­ловых клеток печени, которые, сохраняя способность к пролиферации, могут пре­вращаться в специализированные клетки. При этом используются три типа кле­ток:

· эмбриональные стволовые клетки печени, которые в зависимости от условий культивирования могут превращаться в гепатоциты или клетки желчных ходов (эмбриональные стволовые клетки);

· зрелые гепатоциты, к которым может вернуться способность пролиферировать;

· овальные клетки (клетки печени непаренхиматозного происхождения с вы­раженной способностью к пролиферации).

Стволовые клетки желчных ходов возникают из клеток эндодермы, образую­щих печеночный дивертикул — зачаток, появляющийся на 22-й день эмбриональ­ного развития на брюшной стороне передней эндодермы зародыша человека. Эмбриональные стволовые клетки образуют трабекулы, заселяя мезенхиму поперечной перегородки. Они об­наруживаются в печени эмбриона человека с конца 4-й недели (у крыс с 10-12-го дня). Они пролиферируют и дифференцируются либо в гепатоциты, либо в клет­ки желчных протоков. На этом этапе еще сохраняется дифференцировка. Гепато­бласты могут давать начало клеткам протоков, а из последних образуются оваль­ные клетки — недифференцированные клетки, из которых могут формироваться гепатоциты, клетки желчных ходов и клетки других органов (энтероциты, клетки поджелудочной железы).

Стволовые клетки желчных ходов можно изолировать из эмбриональной пе­чени в конце 2-й недели эмбриогенеза крыс или мышей и культивировать In vitro. В зависимости от условий культивирования эмбриональные стволовые клетки печени могут дифференцироваться в гепатоциты или клетки желчных ходов, которые отличаются по ультраструкту­ре и характерным маркером (альбумин, альфа-фетопротеин, цитокератины 1 и 18 в гепатоцитах и гамма-глутамилтрансфераза — в клетках протоков).

В клетках эндодермы еще до дифференцировки их в эмбриональные стволовые клетки печени экспрессируется ядерный фактор 3 гепатоцитов (фактор роста гепатоцитов 3) — один из наиболее ранних транскрипционных факторов, обнаруженных в печеночном дивертикуле. Вероятно, этот белок регулирует формирование эндодермы и дифференцировку клеток печени, так как экспрессируется раньше других белков, модулирующих транскрипцию.

Эмбриональные стволовые клетки, используемые для лечения печеночной не­достаточности, можно изолировать из эмбриональной печени при прерывании бе­ременности по медицинским показаниям, хотя в таких случаях возникают пробле­мы этического характера. Кроме того, по ряду важных признаков эмбриональные гепатоциты отличаются от зрелых гепатоцитов: глюконеогенез в печени человека начинается лишь на 4-й месяц эмбрионального развития, полярность эпителия ге­патоцитов у крыс исчезает через несколько недель после рождения, эмбриональ­ная печень экспрессирует альфа-фетопротеин, а не альбумин. Таким образом, ге­патоциты эмбриональной печени способны пролиферировать, но функцию пече­ни заменить не могут. Предпринимались попытки лечения молниеносной пече­ночной недостаточности эмбриональными гепатоцитами, которые вводили боль­ным в брюшную полость, но безуспешно.

Обнадеживающие результаты дали исследования по предварительной изоля­ции эмбриональной карциномы печени человека, их культивирования и дифференцировки In vitro. Клетки-предшественники из эмбриональной печени 14-дневного зародыша крысы изоли­ровали и вводили взрослым животным. Эти клетки заселяли пораженную печень животных, формировали печеночные трабекулы и желчные протоки. Такие ре­зультаты дают возможность найти перспективную альтернативу пересадке пече­ни.

Зрелые гепатоциты делятся крайне медленно. В норме в печени только 0, 1-0, 01 % Клеток находятся в состоянии митоза. Частота митозов значительно увеличивает­ся при регенерации печени, например, после частичной гепатэктомии у крыс. В этом случае накопление клеток идет за счет деления зрелых дифференцированных гепатоцитов. Зрелые гепатоциты способны воспроизводить только себе подобных потомков.

Введение нормальных взрослых гепатоцитов в печень трансгенных мышей с тяжелым поражением печени обеспечивает почти полное заселение пораженного органа. Взрослые гепатоциты при этом сохраняли способность к пролиферации. Клетки делились до 77 раз, что сопоставимо с пролиферативной способностью кроветворные стволовые клетки. Успешные результаты были получены и в случае введения взрослых гепатоцитов крысам с приобретенными поражениями печени. Пересаженные клетки контактируют с гепатоцитами хозяина по всей дольке печени, а также с клетками желчных ходов. Они морфологически и функционально сохраняют свойства нормальных взрослых гепатоцитов и не превращаются в протоковые или опухолевые клетки.

В ходе этих исследований возник вопрос о том, все ли гепатоциты обладают спо­собностью к пролиферации. При фракционировании клеток было установлено, что гепатоциты среднего и крупного размера склонны к пролиферации. Они локали­зуются в медиальной и центральной частях печеночной дольки, мелкие — вокруг перипортального пространства. Из-за этой локализации мелких гепатоцитов не­которые исследователи считают их стволовыми клетками печени. Однако в экспериментах по регенерации после частичного удаления печени установлено, что в пролиферации участвуют все гепатоциты, независимо от месторасположения в дольке.

Необходимы дальнейшие исследования по изучению факторов, индуцирую­щих пролиферацию. Известно, что важная роль принадлежит факторам роста. Так, у мышей постоянная перфузия фактора роста гепатоцитов ведет к увеличению массы печени, пролиферации гепатоцитов, увеличению продолжительности жиз­ни гепатоцитов, несущих экзогенные конструкции. Через 1 неделю после введения ретрозина крысам почти все гепатоциты этих животных заменили донорскими клет­ками.