Стволовые клетки костного мозга: независимое происхождение и множественные функции мезенхимы
Традиционно постнатальный костный мозг рассматривался как орган, состоящий из двух систем: кроветворная ткань и ассоциированная с ней поддерживающая строма. Костный мозг — единственное образование, о котором известно, что в нем не только сосуществуют, но и функционально взаимодействуют две отдельные, четко ограниченные стволовые клетки и подчиненные тканевые системы.
Стволовые клетки костного мозга, относящиеся к строме, сначала изучались как играющие решающую роль в формировании микроокружения для кроветворения. В последующем стало известно, что они являются стволовыми/предшествующими клетками для других тканей. Последние данные указывают на возможность дифференциации мозговых клеток стромы в невральную ткань, мышцы, другие ткани, то есть их принадлежность к семейству пластичных соматических стволовых клеток. Эти клетки существуют в ряде постнатальных тканей, проявляющих постнатальную пластичность, то есть способность дифференцироваться в типы клеток, фенотипично не имеющих отношения к клеткам в ткани их происхождения.
А. Я. Фриденштейн первым начал культивировать клетки стромы костного мозга и их трансплантацию лабораторным животным для изучения их биологических характеристик. Так как в костном мозге небольшое количество внеклеточного вещества, то легкое механическое воздействие (пипетирование иглами шприца уменьшающихся размеров) позволяет выделить клетки стромы и гемопоэтические клетки в суспензию разрозненных клеток. При низкой плотности посева клетки стромы быстро срастаются и легко отделяются от несрастающихся гемопоэтических клеток путем повторных промываний. В соответствующих условиях культивирования формируются четкие колонии, каждая из которых происходит из одиночной клетки-предшественника. При оптимальных условиях штаммы мультиколоний могут пройти более 25 пассажей In vitro, демонстрируя высокую способность к самовозобновлению. Таким образом, клетки стромы In vitro легко объединяются, клоногенны и способны к интенсивному размножению.
В последующие годы этой проблеме стали уделять пристальное внимание. Выполнены многочисленные исследования, которые позволили установить следующее. Из зародышевых листков (экто-, эндо — и мезодермы) в процессе эмбриогенеза млекопитающих, включая человека, формируется огромное количество специализированных клеток. Еще одним источником образования специализированных клеток является мезенхима. Эмбриональная мезенхима — клеточная сеть рыхлой соединительной ткани, выполняющая множественные метаболические, сигнальные, опорные и морфогенетические функции. Конденсация мезенхимы за счет клоногенного роста клеток-предшественников запускает синтез первичных морфологических сигналов, ведущих к закладке органов.
Параллельно мезенхима обеспечивает развитие кровеносных и лимфатических сосудов, а также формирует строму (каркас) органов. Выраженная миграция клеток мезенхимы в период органогенеза необходима для «планирования» трехмерного пространства будущих органов и рестрикции действия гомеотических Нох-генов, которые определяют размеры и границы органов.
Независимое происхождение и множественные функции мезенхимы в эмбриогенезе свидетельствуют о важности данной клеточной сети. Внутренние органы (печень, почки, легкие и др.) состоят из морфофункциональных единиц специализированных клеток паренхимы, располагающихся среди сети мезенхимы, которая образует каркас органа, его кровеносные и лимфатические сосуды.
К настоящему времени хорошо изучены стволовые клетки паренхимы многих тканей (нервной, иммунной, кроветворной и др.). В то же время изучение стволовых клеток мезенхимы значительно отстает от них.
Как уже было отмечено выше, первые поиски стволовых клеток мезенхимы проведены еще в 70-е годы XX ст. А. Я. Фриденштейном. Он первым получил однородную культуру плюрипотентных стромальных стволовых клеток костного мозга, фиксированных к подложке, которые сохраняли высокий потенциал размножения, не дифференцируясь. При малых плотностях в культуре стволовые клетки мезенхимы фиксировались к субстрату и формировали клоны фибробластоподобных нефагоцитирующих клеток. В соответствующих условиях культивирования стромальные клетки превращались в костную, жировую, хрящевую, мышечную или соединительную ткань.
При введении стволовых клеток мезенхимы в кровоток животным они внедряются в различные органы и ткани, дифференцируясь там соответственно в клетки крови, миоциты, адипоциты, хрящевые клетки, фибробласты. Введенные в желудочки или белое вещество мозга стволовые клетки мезенхимы мигрируют в ткань мозга и дифференцируются в клетки глии, реже — в нейроны.
В культуре In vitro сеть стромальных клеток-предшественников выполняет питательную роль («фидер») для созревания всех клонов гемопоэза. Основным источником стволовых клеток мезенхимы является костный мозг. Сеть клеток стромы заполняют пространство между капиллярами (синусоидами) и костью. Доля стволовых клеток, находящихся в покое в костном мозге человека, составляет 0, 01-0, 001 %, что сопоставимо с содержанием кроветворных стволовых клеток; баланс между стромальными стволовыми клетками и кроветворными стволовыми клетками играет важную роль в кроветворении. Свежевыделенные стромальные стволовые клетки в суспензии, не прошедшие этап культивирования, не экспрессируют поверхностных рецепторов адгезии (CD34; VCAM; ICAM; коллаген I и III типа; CD44; CD29).
В культуре к подложке прикрепляются не стволовые клетки, а субпопуляции клеток-предшественников, у которых сформирован цитоскелет и аппарат клеточной адгезии. Фиксированные клетки стромы хорошо размножаются в культуре, сохраняя маркеры слабо дифференцированных клеток. Стромальные стволовые клетки не экспрессируют антигенов кроветворные стволовые клетки (CD34; CD14; CD45). Они растут в культуре клонами, часть из которых удается многократно пассировать и получать миллионы генетически однородных плюрипотентных предшественников. В 2-3 пассажа количество клеток достигает от 50 до 300 млн.
После прекращения деления эти клетки дифференцируются в специализированные клетки различных тканей. Фибробласты кроветворной ткани такой способностью не обладают. Так, например, 95 % Адипоцитов образуются из незрелых стромальных клеток при введении в культуральную среду а-1-метилизобутилксантина (повышает уровень внутриклеточного цАМФ), дексаметазона, индометацина (ингибитор синтеза тромбоксана). Фенотип адипоцитов определяется активностью фермента липопротеинлипазы, белка-транспортера жирных кислот и рецептора пероксисом. Из этого же пула стромальных клеток-предшественников получают однородную популяцию хрящевых клеток в культуральной среде, лишенной сыворотки, при добавлении TGF-β.
Дифференцирующиеся клетки формируют многослойную культуру с развитым межклеточным матриксом, который состоит из протеогликана и коллагена II типа. Клетки костной ткани образуются при наличие в культуральной среде глицерофосфата — донора неорганического фосфора, аскорбиновой кислоты и дексаметазона с добавлением 10 % Фетальной сыворотки.