Стволовые клетки костного мозга: независимое происхождение и множественные функции мезенхимы

Традиционно постнатальный костный мозг рассматривался как орган, состоя­щий из двух систем: кроветворная ткань и ассоциированная с ней поддерживаю­щая строма. Костный мозг — единственное образование, о котором известно, что в нем не только сосуществуют, но и функционально взаимодействуют две отдель­ные, четко ограниченные стволовые клетки и подчиненные тканевые системы.

Стволовые клетки костного мозга, относящиеся к строме, сначала изучались как играющие решающую роль в формировании микроокружения для кроветво­рения. В последующем стало известно, что они являются стволовыми/предшеству­ющими клетками для других тканей. Последние данные указывают на возможность дифференциации мозговых клеток стромы в невральную ткань, мышцы, другие ткани, то есть их принадлежность к семейству пластичных соматических стволовых клеток. Эти клетки существуют в ряде постнатальных тканей, проявляющих постнатальную пластичность, то есть способность дифференцироваться в типы клеток, фенотипично не имеющих отношения к клеткам в ткани их происхождения.

А. Я. Фриденштейн первым начал культивировать клетки стромы костного моз­га и их трансплантацию лабораторным животным для изучения их биологических характеристик. Так как в костном мозге небольшое количество внеклеточного ве­щества, то легкое механическое воздействие (пипетирование иглами шприца уменьшающихся размеров) позволяет выделить клетки стромы и гемопоэтичес­кие клетки в суспензию разрозненных клеток. При низкой плотности посева клет­ки стромы быстро срастаются и легко отделяются от несрастающихся гемопоэти­ческих клеток путем повторных промываний. В соответствующих условиях куль­тивирования формируются четкие колонии, каждая из которых происходит из одиночной клетки-предшественника. При оптимальных условиях штаммы мультиколоний могут пройти более 25 пассажей In vitro, демонстрируя высокую спо­собность к самовозобновлению. Таким образом, клетки стромы In vitro легко объе­диняются, клоногенны и способны к интенсивному размножению.

В последующие годы этой проблеме стали уделять пристальное внимание. Вы­полнены многочисленные исследования, которые позволили установить следую­щее. Из зародышевых листков (экто-, эндо — и мезодермы) в процессе эмбриогене­за млекопитающих, включая человека, формируется огромное количество специ­ализированных клеток. Еще одним источником образования специализированных клеток является мезенхима. Эмбриональная мезенхима — клеточная сеть рыхлой соединительной ткани, выполняющая множественные метаболические, сигналь­ные, опорные и морфогенетические функции. Конденсация мезенхимы за счет клоногенного роста клеток-предшественников запускает синтез первичных морфологических сигналов, ведущих к закладке органов.

Параллельно мезенхима обеспе­чивает развитие кровеносных и лимфатических сосудов, а также формирует строму (каркас) органов. Выраженная миграция клеток мезенхимы в период органо­генеза необходима для «планирования» трехмерного пространства будущих орга­нов и рестрикции действия гомеотических Нох-генов, которые определяют раз­меры и границы органов.

Независимое происхождение и множественные функции мезенхимы в эмбрио­генезе свидетельствуют о важности данной клеточной сети. Внутренние органы (печень, почки, легкие и др.) состоят из морфофункциональных единиц специа­лизированных клеток паренхимы, располагающихся среди сети мезенхимы, кото­рая образует каркас органа, его кровеносные и лимфатические сосуды.

К настоящему времени хорошо изучены стволовые клетки паренхимы многих тканей (нерв­ной, иммунной, кроветворной и др.). В то же время изучение стволовых клеток мезенхимы зна­чительно отстает от них.

Как уже было отмечено выше, первые поиски стволовых клеток мезенхимы проведены еще в 70-е годы XX ст. А. Я. Фриденштейном. Он первым получил однородную культуру плюрипотентных стромальных стволовых клеток костного мозга, фиксированных к подложке, которые сохраняли высокий потенциал размножения, не дифференци­руясь. При малых плотностях в культуре стволовые клетки мезенхимы фиксировались к суб­страту и формировали клоны фибробластоподобных нефагоцитирующих клеток. В соответствующих условиях культивирования стромальные клетки превраща­лись в костную, жировую, хрящевую, мышечную или соединительную ткань.

При введении стволовых клеток мезенхимы в кровоток животным они внедряются в различ­ные органы и ткани, дифференцируясь там соответственно в клетки крови, миоциты, адипоциты, хрящевые клетки, фибробласты. Введенные в желудочки или белое вещество мозга стволовые клетки мезенхимы мигрируют в ткань мозга и дифференциру­ются в клетки глии, реже — в нейроны.

В культуре In vitro сеть стромальных клеток-предшественников выполняет пи­тательную роль («фидер») для созревания всех клонов гемопоэза. Основным источником стволовых клеток мезенхимы является костный мозг. Сеть клеток стромы заполняют пространство между капиллярами (синусоидами) и костью. Доля стволовых клеток, находящихся в покое в костном мозге человека, составляет 0, 01-0, 001 %, что сопоставимо с содержанием кроветворных стволовых клеток; баланс между стромальными стволовыми клетками и кроветворными стволовыми клетками иг­рает важную роль в кроветворении. Свежевыделенные стромальные стволовые клетки в суспензии, не прошедшие этап культивирования, не экспрессируют поверхност­ных рецепторов адгезии (CD34; VCAM; ICAM; коллаген I и III типа; CD44; CD29).

В культуре к подложке прикрепляются не стволовые клетки, а субпопуляции клеток-предшественников, у которых сформирован цитоскелет и аппарат клеточной адгезии. Фиксированные клетки стромы хорошо размножаются в культуре, сохраняя мар­керы слабо дифференцированных клеток. Стромальные стволовые клетки не экспрессируют антигенов кроветворные стволовые клетки (CD34; CD14; CD45). Они растут в культуре клонами, часть из которых удается многократно пассировать и получать миллионы генетически однородных плюрипотентных предшественников. В 2-3 пассажа количество клеток достигает от 50 до 300 млн.

После прекращения деления эти клетки дифференцируются в специализирован­ные клетки различных тканей. Фибробласты кроветворной ткани такой способ­ностью не обладают. Так, например, 95 % Адипоцитов образуются из незрелых стромальных клеток при введении в культуральную среду а-1-метилизобутилксантина (повышает уровень внутриклеточного цАМФ), дексаметазона, индометацина (ингибитор синтеза тромбоксана). Фенотип адипоцитов определяется активнос­тью фермента липопротеинлипазы, белка-транспортера жирных кислот и рецеп­тора пероксисом. Из этого же пула стромальных клеток-предшественников полу­чают однородную популяцию хрящевых клеток в культуральной среде, лишен­ной сыворотки, при добавлении TGF-β.

Дифференцирующиеся клетки форми­руют многослойную культуру с развитым межклеточным матриксом, который состоит из протеогликана и коллагена II типа. Клетки костной ткани образуются при наличие в культуральной среде глицерофосфата — донора неорганического фосфора, аскорбиновой кислоты и дексаметазона с добавлением 10 % Фетальной сыворотки.