Селекция стволовых клеток: потенциал использования эмбриональных стволовых клеток как неограниченного источни­ка

Потенциал использования эмбриональных стволовых клеток как неограниченного источни­ка для клеточной трансплантации зависит от доступности большой и очищенной популяции недифференцированных клеток и от возможности эффективно направ­лять их дифференцировку в специфические типы клеток In vitro.
Для поддержания плюрипотентности клетки выращивают в условиях, поддер­живающих их недифференцированный рост и включающих фидерный (питатель­ный) слой инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов.

Установ­лено, что мышиные эмбриональные стволовые клетки способны также поддерживать недиффе­ренцированный рост без питательного слоя в присутствии LIF (ингибиторного фактора лейкемии). Однако спонтанную дифференцировку наблюдают до сих пор даже при оптимальных условиях, особенно клеток человека. Присутствие диффе­ренцирующихся клеток запускает элиминацию плюрипотентных стволовых кле­ток в культуре путем принуждения к дальнейшей дифференцировке или запус­ка программы апоптоза.

Следовательно, при элиминации дифференцирован­ного потомства возможно облегчить поддержание культуры эмбриональных стволовых клеток и получить од­нородную популяцию недифференцированных клеток. Этого можно достичь пу­тем введения в геном эмбриональных стволовых клеток селективного маркера, такого как неомицин, под регуляцией промоторной последовательности, ассоциированной с плюрипотентностью.

Недифференцированные клетки экспрессируют этот ген устойчивости к неомицину, который выключается, когда клетки дифференцируются, обуславливая их немедленную элиминацию путем продолжающейся G 418 селекции.

Недифференцированные клетки можно также пометить In vitro или In vivo пу­тем экспрессии маркерного гена зеленого флуоресцентного протеина (GFP), под контролем промоторов, которые являются специфичными для недифференциро­ванных клеток, таких как регуляторные последовательности Oct 4 или Rex 1. Мет­ка клеток зеленой флуоресценцией позволяет проанализировать их в соответ­ствии с интенсивностью флуоресценции с помощью сортера активированной флуоресценции клеток (FACS). Так можно получить чистую популяцию не­дифференцированных клеток, которые после переноса в другую культуру будут поддерживаться или использоваться для дальнейших исследований.

Аналогичные системы могут быть пригодными для элиминации недифференци­рованных клеток накануне трансплантации во избежание риска индукции опухоли.