Селекция стволовых клеток: потенциал использования эмбриональных стволовых клеток как неограниченного источника
Потенциал использования эмбриональных стволовых клеток как неограниченного источника для клеточной трансплантации зависит от доступности большой и очищенной популяции недифференцированных клеток и от возможности эффективно направлять их дифференцировку в специфические типы клеток In vitro.
Для поддержания плюрипотентности клетки выращивают в условиях, поддерживающих их недифференцированный рост и включающих фидерный (питательный) слой инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов.
Установлено, что мышиные эмбриональные стволовые клетки способны также поддерживать недифференцированный рост без питательного слоя в присутствии LIF (ингибиторного фактора лейкемии). Однако спонтанную дифференцировку наблюдают до сих пор даже при оптимальных условиях, особенно клеток человека. Присутствие дифференцирующихся клеток запускает элиминацию плюрипотентных стволовых клеток в культуре путем принуждения к дальнейшей дифференцировке или запуска программы апоптоза.
Следовательно, при элиминации дифференцированного потомства возможно облегчить поддержание культуры эмбриональных стволовых клеток и получить однородную популяцию недифференцированных клеток. Этого можно достичь путем введения в геном эмбриональных стволовых клеток селективного маркера, такого как неомицин, под регуляцией промоторной последовательности, ассоциированной с плюрипотентностью.
Недифференцированные клетки экспрессируют этот ген устойчивости к неомицину, который выключается, когда клетки дифференцируются, обуславливая их немедленную элиминацию путем продолжающейся G 418 селекции.
Недифференцированные клетки можно также пометить In vitro или In vivo путем экспрессии маркерного гена зеленого флуоресцентного протеина (GFP), под контролем промоторов, которые являются специфичными для недифференцированных клеток, таких как регуляторные последовательности Oct 4 или Rex 1. Метка клеток зеленой флуоресценцией позволяет проанализировать их в соответствии с интенсивностью флуоресценции с помощью сортера активированной флуоресценции клеток (FACS). Так можно получить чистую популяцию недифференцированных клеток, которые после переноса в другую культуру будут поддерживаться или использоваться для дальнейших исследований.
Аналогичные системы могут быть пригодными для элиминации недифференцированных клеток накануне трансплантации во избежание риска индукции опухоли.