Ряд экспериментальных исследований посвящен изучению терапевтического эффекта трансплантируемых стволовых клеток

Ряд экспериментальных исследований посвящен изучению терапевтического эффекта трансплантируемых стволовых клеток при травме головного мозга. Так, нативные или криоконсервированные клетки NTera-2 вводили в зону механического повреж­дения коры головного мозга крыс. Гистологические исследования, проведенные через 2 и 4 недели, показали высокую выживаемость трансплантированных клеток, а иммуноцитохимические реакции с применением антител МОС-1, специфичных в отношении молекул клеточной адгезии нейронов человека, позволили устано­вить формирование отростков у трансплантированных клеток и их врастание в ткань мозга реципиента. Однако двигательные функции не восстанавливались.

При повреждении спинного мозга в качестве трансплантата использовали эмбриональные стволовые клетки линии ROSA26, которые предварительно подверглись кратковременному воздей­ствию ретиноевой кислоты (клетки вводили в зону контузии спинного мозга че­рез 9 дней после нанесения травмы). Через 2-5 недель в области трансплантации и на расстоянии 8 мм от повреждения находили дифференцированные олигоден­дроциты (43%), астроциты (19%), нейроны (8%). У животных этой группы на­блюдали частичное восстановление координации моторных функций задних ко­нечностей.

Таким образом, результаты экспериментальных исследований показали, что стволовые клетки способны стимулировать регенерацию поврежденных и замещать погибшие ней­роны при острой патологии и нейродегенеративных заболеваниях центральной нервной системы. Их мож­но использовать для генной терапии, применяя клонированные стволовых клеток, экспрессирующие продукты, необходимые для восполнения утраченных вследствие повреж­дения или заболевания нейрогуморальных факторов. Так как стволовые клетки можно генети­чески модифицировать, а также, учитывая их способность к направленной мигра­ции в очаге поражения, предполагается их использование в качестве средства дос­тавки биологически активных веществ, стимулирующих регенеративные процес­сы в центральной нервной системе.

Параллельно с экспериментальными исследованиями ведутся клинические испытания относительно возможности применения стволовых клеток в лечении заболеваний центральной нервной системы. Так, в 2000 г. закончились первые клинические испытания по проверке бе­зопасности пересадки нейробластов, полученных из стволовых клеток тератокарциномы NIera-1 человека. Незрелые клетки размножали многократным пассажированием и полу­чали биомассу 50-100 млн клеток. В части клеток исследовали фенотип и процент примесей, отсутствие контаминации вирусами и бактериями. Затем из питатель­ной среды убирали LIF и фидерный слой клеток, создавая условия для направ­ленной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в нейроны.

Состав смеси, индуцирующий 95%-ю дифференцировку эмбриональных стволовых клеток в нейроны, фирма «БиоЛейтон» (США) не разглашает. Культуру нейробластов пропускали через проточный сортер для удаления незре­лых клеток тератокарциномы. После повторной очистки и определения феноти­па, тщательно подготовленные клетки (10-12 млн нейробластов) с помощью спе­циальной микроканюли и шприца вводили под контролем стереотаксиса и ком­пьютерной томографии в базальное ядро мозга больному через 6 месяцев после гемор­рагического инсульта. Скрининг (12 месяцев) последствий трансплантации клеток в зону инсульта показал отсутствие побочных нежелательных эффектов в 100 % Слу­чаев.

У половины больных развивалось достоверное улучшение моторной симп­томатики в период 6-12 месяцев после трансплантации. Положительный клини­ческий эффект сопровождался параллельным улучшением кровоснабжения зоны инсульта после трансплантации клеток. Средний прирост поглощения 2-дезоксиглюкозы (меченой флуоресцентной меткой), определенный с помощью позитронной эмиссионной томографии, составлял 18%, а у некоторых пациентов достигал 35-40%. В настоящее время клинические испытания проводятся также в ряде неврологических центров США и Европы.

Трансплантацию фетальных эксплантатов в substatia nigra для локального за­мещения утраченных ДОФА-эргических нейронов в мозге больных паркинсониз­мом, страдающих выраженными двигательными расстройствами, стали использо­вать еще с середины 80-х годов XX ст. Предварительные опыты на животных под­твердили необходимость направленной доставки в ограниченную зону мозга до­фамина. Никакой необходимости одновременного восстановления нейрональных электрических сетевых связей между донорскими и реципиентными нейронами не выставлялись в качестве условий лечения. Сначала на мышах была разработа­на технология наработки большого количества ДОФА-нейронов для пересадки в путамен и substatia nigra мышам с модельным паркинсонизмом.

Около полови­ны нейронов выживали. Оказалось, что пересадка популяций клеток-предшествен­ников, в отличие от дифференцированных нейронов, позволяет создавать ростки обновленных клеток. Клетки-предшественники более эффективно, стабиль­но и долгосрочно доставляют дефицитные молекулы медиатора либо продукт нор­мального аллеля гена прямо в зону повреждения.

По этой же причине предпочтение отдается технологиям выращивания миелин-продуцирующих олигодендроцитов из эмбриональных стволовых клеток, чтобы создавать в зоне повреждения ростки регенерации из всей иерархии необходимых для регенерации клеток. Сначала размножают эмбриональные стволовые клетки до определенного количества, достаточного для эффек­тивной трансплантации. Затем полученную массу недифференцированных клеток направленно превращают в популяцию миелинпродуцирующих предшественни­ков олигодендроцитов, которые маркируются селективными антигенами. Популяции проолигодендроцитов лучше использовать для трансплантации в ме­сто демиелинизации. Смешанные популяции, сохраняющие активно мигрирую­щие предшественники, целесообразно вводить в боковой желудочек, так как клетки-предшественники обладают способностью мигрировать к очагам демиелинизации и механической травмы.

В экспериментах на нокаут-мышах была обоснована концепция лечения путем направленной «химеризации» больного мозга ростка­ми здоровой нервной ткани, клетки которых интенсивно мигрируют в случае ис­пользования ранних предшественников. Сейчас такой подход широко использу­ется в экспериментах и первых клинических испытаниях для коррекции травмы головного и спинного мозга, лечения сфирингомиелии, рассеянного склероза, на­следственных дефектов мозжечка и другой патологии.

Рядом исследований на экспериментальных моделях внутримозговой алло — и кленотрансплантации эмбриональных стволовых клеток, нервных стволовых клеток и клеток-предшественников, выделенных из эмбрионального и зрело­го мозга животных и человека, установлено, что трансплантированные клетки обладали способностью к пролиферации, ориентированной миграции и терминаль­ной дифференциации в нервные и глиальные клетки.

Для идентификации трансплантированных клеток применяют 5-бромдезоксп-уридин (BrdU) — аналог тимидина, который включается в состав ДНК пролиферирующих клеток. Визуализация меченых клеток осуществляется с помощью ан­тител к BrdU. Плазмиды, построенные на осно­ве этого белка и Tal-тубулина позволяют маркировать исключительно нейрональные клетки-предшественники и незрелые нейроны. Может быть использован как специфический ядер­ный маркер нейральных клеток-предшественников — Neu-N.

При внутриматочной трансплантации клеток-предшественников в развивающийся мозг 15-18-днев­ных эмбрионов крыс и 15-дневных мышиных эмбрионов донорские клетки сохра­нялись и дифференцировались не только в месте введения, но и мигрировали в другие структуры мозга, где формировали нейрональные фенотипы, характерные для этих структур.

Нервные стволовые клетки, выделенные из гиппокампа и введенные в гиппокамп, превращались в нейроны, похожие на нейроны зубчатой фасции. Клетки это­го типа, имплантированные в построенный миграционный тракт, мигрировали в обонятельную луковицу и превращались в нейроны, которые экспрессировали характерную для них тирозингидроксилазу, типичную для этого образования, но не для гиппокампа.