Ряд экспериментальных исследований посвящен изучению терапевтического эффекта трансплантируемых стволовых клеток
Ряд экспериментальных исследований посвящен изучению терапевтического эффекта трансплантируемых стволовых клеток при травме головного мозга. Так, нативные или криоконсервированные клетки NTera-2 вводили в зону механического повреждения коры головного мозга крыс. Гистологические исследования, проведенные через 2 и 4 недели, показали высокую выживаемость трансплантированных клеток, а иммуноцитохимические реакции с применением антител МОС-1, специфичных в отношении молекул клеточной адгезии нейронов человека, позволили установить формирование отростков у трансплантированных клеток и их врастание в ткань мозга реципиента. Однако двигательные функции не восстанавливались.
При повреждении спинного мозга в качестве трансплантата использовали эмбриональные стволовые клетки линии ROSA26, которые предварительно подверглись кратковременному воздействию ретиноевой кислоты (клетки вводили в зону контузии спинного мозга через 9 дней после нанесения травмы). Через 2-5 недель в области трансплантации и на расстоянии 8 мм от повреждения находили дифференцированные олигодендроциты (43%), астроциты (19%), нейроны (8%). У животных этой группы наблюдали частичное восстановление координации моторных функций задних конечностей.
Таким образом, результаты экспериментальных исследований показали, что стволовые клетки способны стимулировать регенерацию поврежденных и замещать погибшие нейроны при острой патологии и нейродегенеративных заболеваниях центральной нервной системы. Их можно использовать для генной терапии, применяя клонированные стволовых клеток, экспрессирующие продукты, необходимые для восполнения утраченных вследствие повреждения или заболевания нейрогуморальных факторов. Так как стволовые клетки можно генетически модифицировать, а также, учитывая их способность к направленной миграции в очаге поражения, предполагается их использование в качестве средства доставки биологически активных веществ, стимулирующих регенеративные процессы в центральной нервной системе.
Параллельно с экспериментальными исследованиями ведутся клинические испытания относительно возможности применения стволовых клеток в лечении заболеваний центральной нервной системы. Так, в 2000 г. закончились первые клинические испытания по проверке безопасности пересадки нейробластов, полученных из стволовых клеток тератокарциномы NIera-1 человека. Незрелые клетки размножали многократным пассажированием и получали биомассу 50-100 млн клеток. В части клеток исследовали фенотип и процент примесей, отсутствие контаминации вирусами и бактериями. Затем из питательной среды убирали LIF и фидерный слой клеток, создавая условия для направленной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в нейроны.
Состав смеси, индуцирующий 95%-ю дифференцировку эмбриональных стволовых клеток в нейроны, фирма «БиоЛейтон» (США) не разглашает. Культуру нейробластов пропускали через проточный сортер для удаления незрелых клеток тератокарциномы. После повторной очистки и определения фенотипа, тщательно подготовленные клетки (10-12 млн нейробластов) с помощью специальной микроканюли и шприца вводили под контролем стереотаксиса и компьютерной томографии в базальное ядро мозга больному через 6 месяцев после геморрагического инсульта. Скрининг (12 месяцев) последствий трансплантации клеток в зону инсульта показал отсутствие побочных нежелательных эффектов в 100 % Случаев.
У половины больных развивалось достоверное улучшение моторной симптоматики в период 6-12 месяцев после трансплантации. Положительный клинический эффект сопровождался параллельным улучшением кровоснабжения зоны инсульта после трансплантации клеток. Средний прирост поглощения 2-дезоксиглюкозы (меченой флуоресцентной меткой), определенный с помощью позитронной эмиссионной томографии, составлял 18%, а у некоторых пациентов достигал 35-40%. В настоящее время клинические испытания проводятся также в ряде неврологических центров США и Европы.
Трансплантацию фетальных эксплантатов в substatia nigra для локального замещения утраченных ДОФА-эргических нейронов в мозге больных паркинсонизмом, страдающих выраженными двигательными расстройствами, стали использовать еще с середины 80-х годов XX ст. Предварительные опыты на животных подтвердили необходимость направленной доставки в ограниченную зону мозга дофамина. Никакой необходимости одновременного восстановления нейрональных электрических сетевых связей между донорскими и реципиентными нейронами не выставлялись в качестве условий лечения. Сначала на мышах была разработана технология наработки большого количества ДОФА-нейронов для пересадки в путамен и substatia nigra мышам с модельным паркинсонизмом.
Около половины нейронов выживали. Оказалось, что пересадка популяций клеток-предшественников, в отличие от дифференцированных нейронов, позволяет создавать ростки обновленных клеток. Клетки-предшественники более эффективно, стабильно и долгосрочно доставляют дефицитные молекулы медиатора либо продукт нормального аллеля гена прямо в зону повреждения.
По этой же причине предпочтение отдается технологиям выращивания миелин-продуцирующих олигодендроцитов из эмбриональных стволовых клеток, чтобы создавать в зоне повреждения ростки регенерации из всей иерархии необходимых для регенерации клеток. Сначала размножают эмбриональные стволовые клетки до определенного количества, достаточного для эффективной трансплантации. Затем полученную массу недифференцированных клеток направленно превращают в популяцию миелинпродуцирующих предшественников олигодендроцитов, которые маркируются селективными антигенами. Популяции проолигодендроцитов лучше использовать для трансплантации в место демиелинизации. Смешанные популяции, сохраняющие активно мигрирующие предшественники, целесообразно вводить в боковой желудочек, так как клетки-предшественники обладают способностью мигрировать к очагам демиелинизации и механической травмы.
В экспериментах на нокаут-мышах была обоснована концепция лечения путем направленной «химеризации» больного мозга ростками здоровой нервной ткани, клетки которых интенсивно мигрируют в случае использования ранних предшественников. Сейчас такой подход широко используется в экспериментах и первых клинических испытаниях для коррекции травмы головного и спинного мозга, лечения сфирингомиелии, рассеянного склероза, наследственных дефектов мозжечка и другой патологии.
Рядом исследований на экспериментальных моделях внутримозговой алло — и кленотрансплантации эмбриональных стволовых клеток, нервных стволовых клеток и клеток-предшественников, выделенных из эмбрионального и зрелого мозга животных и человека, установлено, что трансплантированные клетки обладали способностью к пролиферации, ориентированной миграции и терминальной дифференциации в нервные и глиальные клетки.
Для идентификации трансплантированных клеток применяют 5-бромдезоксп-уридин (BrdU) — аналог тимидина, который включается в состав ДНК пролиферирующих клеток. Визуализация меченых клеток осуществляется с помощью антител к BrdU. Плазмиды, построенные на основе этого белка и Tal-тубулина позволяют маркировать исключительно нейрональные клетки-предшественники и незрелые нейроны. Может быть использован как специфический ядерный маркер нейральных клеток-предшественников — Neu-N.
При внутриматочной трансплантации клеток-предшественников в развивающийся мозг 15-18-дневных эмбрионов крыс и 15-дневных мышиных эмбрионов донорские клетки сохранялись и дифференцировались не только в месте введения, но и мигрировали в другие структуры мозга, где формировали нейрональные фенотипы, характерные для этих структур.
Нервные стволовые клетки, выделенные из гиппокампа и введенные в гиппокамп, превращались в нейроны, похожие на нейроны зубчатой фасции. Клетки этого типа, имплантированные в построенный миграционный тракт, мигрировали в обонятельную луковицу и превращались в нейроны, которые экспрессировали характерную для них тирозингидроксилазу, типичную для этого образования, но не для гиппокампа.