Поддержание митотической активности стволовых клеток во вре­мени в культуре In vitro: источники новых нейронов

Важным является вопрос о поддержании митотической активности стволовых клеток во вре­мени в культуре In vitro. По данным многих, хотя и противоречивых результатов, для нервной стволовой клетки предел Хейфлика пока не достижим в эксперименте. В первых исследованиях было установлено, что стволовые клетки в нейросферах сохраняли свои свойства на протяжении 7 месяцев при 8 пассажах. Оказалось, что в поддержании жизне­способности нейросфер имеет значение способ их дисперсии при каждом пасса­же. Пассажирование нейросфер необходимо, так как превышение ими определен­ных размеров приводит к гибели клеток из-за снижения проникновения питательных веществ в центральные отделы нейросфер.

Как трипсинизация или воздей­ствие другими литическими ферментами, так и механические воздействия, при­меняемые для диссоциации клеток, значительно снижают пролиферативную ак­тивность клеток из-за нарушения клеточных контактов. Разделение нейросфер из клеток человека на четыре части значительно повышало жизнеспособность клеток при пассажировании. Метод позволил поддерживать культуру стволовых нервных клеток человека до 300 дней.

Все культуры прекращали митотическую активность между 250-300 сутками культивирования и претерпевали дегенератив­ные изменения или начинали дифференцировку в нейроны или астроциты. Ко­личество митозов в среднем составляло 30 и, вероятно, соответствовало пределу для стволовых нервных клеток. Астроциты человека поддерживают жизне­способность в течение 40 митозов. Прекращение митотической активности в куль­туре нервных стволовых клеток — значимый факт, свидетельствующий об отсутствии спонтанной онкогенетической трансформации клеток.

Культуры стволовых нейральных клеток отличались способностью формиро­вать большое количество нейронов (более 40 % Всех дифференцированных клеток) в течение 150 дней культивирования, что принципиально отличается от нейросфер, полученных от мышей и крыс, дающих не более 5 и 1 % Нейронов соответственно даже на ранних пассажах. В отличие от нейросфер грызунов, нейросферы челове­ка формировали гораздо меньше олигодендроцитов, что имеет важное значение, учитывая перспективы клеточной терапии демиелинизирующих заболеваний. При добавлении культуральной среды В104 значительно повышалось образова­ние олигодендроцитов.

Похожая статья  Пластичность трансплантированных мультипотентных нейральных клеток-предшественников: результаты исследований

Подавляющее количество формирующихся нейронов у грызунов и человека является ГАМК-ергическими. Дофаминергические нейроны, необходимые для ле­чения болезни Паркинсона, образуются из клеток-предшественников, выделенных из развивающегося мозга грызунов только при первых пассажах. Дальнейшее пассажирование клеток приводит к образованию исключительно ГАМК-ергических клеток. Индуцирующими факторами дофаминергических нейронов у грызу­нов являются ИЛ-1 и ИЛ-11, фрагменты мембран клеток, лейкозингибирующий фактор (LIF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF). Аналогичный методический подход в отношении клеток человека, к сожалению, не позволяет получить дофаминергические нейроны при длительном пассажировании.

В течение всего пренатального периода происходит развитие мозга и в нем про­должается нейрогенез. В эти сроки нейроэпителий нервной трубки формирует многослойную структуру. Полученные результаты свидетельствуют, что источни­ком новых нейронов в это время является радиальная глия, представленная вы­тянутыми клетками с длинными отростками, которые имеют радиальное направ­ление по отношению к стенке мозговых пузырей и контактируют с внутренней поверхностью желудочков и наружной пиальной поверхностью стенки мозга.

Обычно радиальная глия рассматривалась как механический остов, необходимый для миграции нейробластов из вентральной области в поверхностные отделы и формирования правильной ламинарной организации коры. В процессе развития радиальная глия трансдифференцируется в астроциты. У млекопитающих боль­шая часть радиальной глии исчезает в ранние сроки после рождения. У других животных радиальная глия сохраняется до зрелого возраста и, как правило, ней­рогенез у них активно продолжается в постнатальном периоде. В более поздние сроки эмбриогенеза (18-е сутки) дифференцировка направлялась в сто­рону астроцитов, при этом образование нейронов уменьшалось.

При маркировке радиальной глии In situ путем введения в полость мозговых пузырей 15-16-суточных зародышей крысы ретровируса, связанного с зеленым флуоресцирующим бел­ком (ЗФБ), исследователям удалось наблюдать динамику асимметричного деле­ния клетки радиальной глии с образованием дочерней клетки, имеющей имму­нологические и электрофизиологические характеристики нейробласта. Об­разовавшиеся нейробласты использовали материнскую клетку радиальной глии для своей миграции к пиальной поверхности.

Похожая статья  Настойка прополиса на спирту: как изготавливается, чем может быть полезна

Белок промежуточных филаментов — нестин — является маркером радиаль­ной глии. С помощью метода флуоресцентной проточной сортировки клеток, ме­ченых ретровирусом, связанным с ЗФБ, который экспрессируется под контролем нестина, было установлено, что стволовые клетки гиппокампа (области зубчатой извилины и хи­муса) человека (материал был получен при операциях по поводу эпилепсии) яв­ляются нестинэкспрессирующими. Следовательно, их можно рассматривать как радиальную глию. У человека, как и у других млекопитающих, радиальная глия сохраняется в зубчатой извилине.

Идентификацию стволовых клеток до их культивирования проводят на скрининге антигенов стволовых клеток, в частности кроветворения, и выбирают те из них, которые соответствуют нейральным стволовым клеткам. С помощью этого метода определены маркеры для проточной сор­тировки (CD133+, 5Т12+, CD34, CD45, CD24) и получены клетки, образующие In vitro нейросферы и способные дифференцироваться в нейроны при пересадке в головной мозг поврежденных мышей с иммунодефицитом.

Источниками новых нейронов в зрелом головном мозге млекопитающих и че­ловека, по общему мнению, служат субвентрикулярная зона (нейроны обонятель­ных луковиц) и зубчатая извилина гиппокампа (клетки-зерна). Стволовыми клет­ками в обеих областях являются клетки, которые экспрессируют глиальный кис­лый фибриллярный белок (ГКФБ). Так как ГКФБ был выявлен толь­ко в астроцитах, следовательно, в зрелой центральной нервной системе этот тип клеток включает нервные стволовые клетки. Это было доказано на трансгенных мышах, экспрессирующих рецепторы ретровируса птичьего лейкоза под контролем ГКФБ.

Нейроны, происходящие из ГКФБ-положительных предшественников, были обнаружены в обонятельных луковицах и зубчатой извилине. Эти результаты противоречат представлению о том, что в этой области мозга стволовыми являются клетки радиальной глии, которая не экспрессирует ГКФБ в зубчатой извилине в зрелом возрасте. Возможно, речь идет о двух популяциях стволовых клеток или же имеет место несовершенная иммунологическая диагнос­тика In situ.

Похожая статья  Мозг — это орган центральной нервной системы человека, самый сложный в человеческом организме

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

*

code