Отличительное свойство стволовых клеток: клетки, полученные из костного мозга, клетки-предшественники лимфопоэза

Исследовали различные долгоживущие в культуре первичные клетки (LTC-IC); исследуемые клетки культивировали 5-10 недель, получая стромальные клетки, по­добные костномозговым, которые формируют микроокружение. На втором этапе клетки переносили на полуплотную среду, содержащую цитокины. Клетки первичной культуры, которые сохраняли свою пролиферативную активность (LTC-IC), генерировали миелоэригроидные или В-клеточные колонии. Эти исследования полезны для определения примитивных клеток-предшественников и доказывают их способность к самовозобновлению или наличия по­тенциала мультилинейной дифференцировки.

Для изучения кроветворения человека в моделях на животных необходимо со­блюдение двух условий: хозяин должен быть лишен иммунореактивности и обес­печить оптимальное микроокружение для внедрения и дифференцировки клеток донора. Иммунодефитдитные мыши частично соответствуют этим критериям. Пер­вые исследования были проведены на SCID-мышах, у которых проявляется де­фект Т — и В-клеток, и beige/nude/xid (bnx) мышах с дефектом NK-, Т — и В-клеток. Однако обе породы мышей могут отторгнуть ксенотрансплантат из-за активности макрофагов и NK-клеток. Для преодоления этих недостатков SCID-мыши скрестили с мышами-диабетиками (NOD), у которых несостоятель­ны NK — АПК-клетки и макрофаги.

Для улучшения микроокружения для клеток человека, их воспроизводства, пролиферации, мультилинейного развития SCID-мышам трансплантировали фетальные кость, тимус, печень или лимфоузлы (SCIDhn-модель) и мышам-реципиентам вводили рекомбинантные цитокины человека или генетически модифицировали для продукции цитокинов человека. Приживляемость трансплантата у таких мышей в 10-20 раз выше, чем у SCID-мышей. Учитывая такую несложную технологию и относительно ма­лую стоимость, NOD-SCID-мыши широко используются для исследования раз­личных процессов кроветворения человека In vivo.

Такие мыши, однако, очень чувствительны к облучению, трансплантат может исследоваться до 6 месяца из-за ограниченной продолжительности жизни этих мышей. Для устранения указан­ных недостатков были разработаны другие модели, такие как NOD-SCID (32-микроглобулин нокаут-мыши, NOD-RAG1 нокаут-мыши, NOD/SCID трижды мутированные мыши, дважды мутанты-мыши RAG2 общего цитокинового рецептора.

Отличительное свойство стволовых клеток — способность уравновешивать самовоспроизве­дение и дифференцировку. До сих пор не совсем понятно, в результате экзоген­ных или эндогенных сигналов происходит дифференцировка кроветворных стволовых клеток через ограни­ченное количество предшественников до созревания в эффекторную клетку.

В любом случае молекулярные механизмы этого процесса отражены в экспрес­сии генов стволовыми клетками и клетками-предшественниками по иерархии дифференцировки. На каждом определенном этапе гены, связанные с выбранным путем дифференциров­ки, подвергаются разблокированию, в то время как гены, необходимые для дру­гих путей, подавляются. Понимание этих механизмов, как отмечалось выше, было достигнуто в исследованиях по изучению относительных уровней экспрессии из­вестных общих для определенной линии генов.

В первых исследованиях, предпринятых в данном направлении, использовались линии полипотентных кроветворных клеток для моделирования поведения кроветворных стволовых клеток. Для этого широко использовались факторзависимые клетки Паттерсона (mix cells), так как они представляют собой кариотипически нормальные, нелейкогенные клетки, которые отвечают на цитокины формированием линейной направлен­ности, то есть образованием гранулоцитов и моноцитов в ответ на Г-КСФ и ГМ-КСФ, эритроцитов в ответ на эритропоэтин.

Дальнейшие иссле­дования показали, что эритропоэтиновый рецептор (EPOR) и GATA-1 — эритроидный фактор транскрипции — слабо экспрессировались, и что в промоторе EPOR и конт­рольном локусе Р-глобина присутствуют высокочувствительные сайты, указывая на то, что в этих клетках хроматиновые структуры находятся в открытой актив­ной форме до начала дифференцировки.

Одинаковую экспрессию эритроидных и гранулоцит/макрофагальных специ­фических генов показал RT-PCR-анализ отдельных клеток Паттерсона и СD34+ Lin клеток-предшественников человека. Эти результаты позволили предположить, что стволовые клетки и клетки-предшественники подготовлены к многолинейной дифференци­ровке экспрессией линейных групп генов.

Более точный анализ был проведен с выделенными кроветворными стволовыми клетками и клетками-предше­ственниками. Он показал одинаковую экспрессию объединенных происхождени­ем генов. Так, 16 % Отдельных кроветворных стволовых клеток экспрессировали эритроидспецифические (р-глобин и EPOR), гранулоцит/макрофаг-специфические (миелопероксидазы, рецептор Г-КСФ) гены. Около 39 % Клеток-предшественников миелопоэза — сле­дующая линейная стадия в миелоидном ряду — показали разнородную экспрес­сию генов. Важно то, что следующие клетки-предшественники миелопоэза, гранулоцито-моноцитопоэза и эритропоэза экспрессировали только свойственные этим линиям транскрипты.

Точно также 23 % Отдельных клеток-предшественников лимфопоэза экспрессировали только специфические В-клеток (Х5 и/или Рах5) и Т-клеток (CD3 или GATA-3) гены, тогда как предшественники В — и Т-лимфоцитов экспрессировали только для них характерные гены. Эти исследования по­казали, что низкоуровневая беспорядочная экспрессия специфических генов пред­шествует коммитированию в специфические линии и может быть необходимой для полипотентных клеток-предшественников.

Координированное угнетение одних и активация других генов — механизм, с помощью которого клетки выбирают один путь дифференцировки, исключая дру­гие. Сила и слабость этих генных механизмов заключается в большом количестве генов. Предстоит еще значительная работа по выяснению роли этих генов в изме­нении баланса, который существует между самовоспроизведением, полипотентностью и дифференцировкой и установлению тех генов, которые дают возможность клетке получить сигнал к дифференцировке и ответить на него.

Идея о том, что потенциал развития кроветворных стволовых клеток не ограничивается только кроветвор­ными клетками, появилась на основании ряда опубликованных работ, указываю­щих на то, что клетки, полученные из костного мозга, способны давать начало мно­гочисленным «неожиданным» типам клеток. К ним относятся клетки:

· нервной си­стемы,

· скелетных мышц,

· миокарда,

· печени,

· эпителия кишечника,

· кожи,

· легких,

· почек.

Возникло предположение, что в основе этих явлений лежит «трансдифференцировка» кроветворныех стволовых клеток костного мозга. Но прямых доказательств этому пока нет. В большинстве исследований анализу подверглись неочищенные или частично очи­щенные популяции клеток. Почти ни в одном из них не анализировались отдель­ные клетки, что требуется для доказательства полипотентности.