Отличительное свойство стволовых клеток: клетки, полученные из костного мозга, клетки-предшественники лимфопоэза
Исследовали различные долгоживущие в культуре первичные клетки (LTC-IC); исследуемые клетки культивировали 5-10 недель, получая стромальные клетки, подобные костномозговым, которые формируют микроокружение. На втором этапе клетки переносили на полуплотную среду, содержащую цитокины. Клетки первичной культуры, которые сохраняли свою пролиферативную активность (LTC-IC), генерировали миелоэригроидные или В-клеточные колонии. Эти исследования полезны для определения примитивных клеток-предшественников и доказывают их способность к самовозобновлению или наличия потенциала мультилинейной дифференцировки.
Для изучения кроветворения человека в моделях на животных необходимо соблюдение двух условий: хозяин должен быть лишен иммунореактивности и обеспечить оптимальное микроокружение для внедрения и дифференцировки клеток донора. Иммунодефитдитные мыши частично соответствуют этим критериям. Первые исследования были проведены на SCID-мышах, у которых проявляется дефект Т — и В-клеток, и beige/nude/xid (bnx) мышах с дефектом NK-, Т — и В-клеток. Однако обе породы мышей могут отторгнуть ксенотрансплантат из-за активности макрофагов и NK-клеток. Для преодоления этих недостатков SCID-мыши скрестили с мышами-диабетиками (NOD), у которых несостоятельны NK — АПК-клетки и макрофаги.
Для улучшения микроокружения для клеток человека, их воспроизводства, пролиферации, мультилинейного развития SCID-мышам трансплантировали фетальные кость, тимус, печень или лимфоузлы (SCIDhn-модель) и мышам-реципиентам вводили рекомбинантные цитокины человека или генетически модифицировали для продукции цитокинов человека. Приживляемость трансплантата у таких мышей в 10-20 раз выше, чем у SCID-мышей. Учитывая такую несложную технологию и относительно малую стоимость, NOD-SCID-мыши широко используются для исследования различных процессов кроветворения человека In vivo.
Такие мыши, однако, очень чувствительны к облучению, трансплантат может исследоваться до 6 месяца из-за ограниченной продолжительности жизни этих мышей. Для устранения указанных недостатков были разработаны другие модели, такие как NOD-SCID (32-микроглобулин нокаут-мыши, NOD-RAG1 нокаут-мыши, NOD/SCID трижды мутированные мыши, дважды мутанты-мыши RAG2 общего цитокинового рецептора.
Отличительное свойство стволовых клеток — способность уравновешивать самовоспроизведение и дифференцировку. До сих пор не совсем понятно, в результате экзогенных или эндогенных сигналов происходит дифференцировка кроветворных стволовых клеток через ограниченное количество предшественников до созревания в эффекторную клетку.
В любом случае молекулярные механизмы этого процесса отражены в экспрессии генов стволовыми клетками и клетками-предшественниками по иерархии дифференцировки. На каждом определенном этапе гены, связанные с выбранным путем дифференцировки, подвергаются разблокированию, в то время как гены, необходимые для других путей, подавляются. Понимание этих механизмов, как отмечалось выше, было достигнуто в исследованиях по изучению относительных уровней экспрессии известных общих для определенной линии генов.
В первых исследованиях, предпринятых в данном направлении, использовались линии полипотентных кроветворных клеток для моделирования поведения кроветворных стволовых клеток. Для этого широко использовались факторзависимые клетки Паттерсона (mix cells), так как они представляют собой кариотипически нормальные, нелейкогенные клетки, которые отвечают на цитокины формированием линейной направленности, то есть образованием гранулоцитов и моноцитов в ответ на Г-КСФ и ГМ-КСФ, эритроцитов в ответ на эритропоэтин.
Дальнейшие исследования показали, что эритропоэтиновый рецептор (EPOR) и GATA-1 — эритроидный фактор транскрипции — слабо экспрессировались, и что в промоторе EPOR и контрольном локусе Р-глобина присутствуют высокочувствительные сайты, указывая на то, что в этих клетках хроматиновые структуры находятся в открытой активной форме до начала дифференцировки.
Одинаковую экспрессию эритроидных и гранулоцит/макрофагальных специфических генов показал RT-PCR-анализ отдельных клеток Паттерсона и СD34+ Lin клеток-предшественников человека. Эти результаты позволили предположить, что стволовые клетки и клетки-предшественники подготовлены к многолинейной дифференцировке экспрессией линейных групп генов.
Более точный анализ был проведен с выделенными кроветворными стволовыми клетками и клетками-предшественниками. Он показал одинаковую экспрессию объединенных происхождением генов. Так, 16 % Отдельных кроветворных стволовых клеток экспрессировали эритроидспецифические (р-глобин и EPOR), гранулоцит/макрофаг-специфические (миелопероксидазы, рецептор Г-КСФ) гены. Около 39 % Клеток-предшественников миелопоэза — следующая линейная стадия в миелоидном ряду — показали разнородную экспрессию генов. Важно то, что следующие клетки-предшественники миелопоэза, гранулоцито-моноцитопоэза и эритропоэза экспрессировали только свойственные этим линиям транскрипты.
Точно также 23 % Отдельных клеток-предшественников лимфопоэза экспрессировали только специфические В-клеток (Х5 и/или Рах5) и Т-клеток (CD3 или GATA-3) гены, тогда как предшественники В — и Т-лимфоцитов экспрессировали только для них характерные гены. Эти исследования показали, что низкоуровневая беспорядочная экспрессия специфических генов предшествует коммитированию в специфические линии и может быть необходимой для полипотентных клеток-предшественников.
Координированное угнетение одних и активация других генов — механизм, с помощью которого клетки выбирают один путь дифференцировки, исключая другие. Сила и слабость этих генных механизмов заключается в большом количестве генов. Предстоит еще значительная работа по выяснению роли этих генов в изменении баланса, который существует между самовоспроизведением, полипотентностью и дифференцировкой и установлению тех генов, которые дают возможность клетке получить сигнал к дифференцировке и ответить на него.
Идея о том, что потенциал развития кроветворных стволовых клеток не ограничивается только кроветворными клетками, появилась на основании ряда опубликованных работ, указывающих на то, что клетки, полученные из костного мозга, способны давать начало многочисленным «неожиданным» типам клеток. К ним относятся клетки:
· нервной системы,
· скелетных мышц,
· миокарда,
· печени,
· эпителия кишечника,
· кожи,
· легких,
· почек.
Возникло предположение, что в основе этих явлений лежит «трансдифференцировка» кроветворныех стволовых клеток костного мозга. Но прямых доказательств этому пока нет. В большинстве исследований анализу подверглись неочищенные или частично очищенные популяции клеток. Почти ни в одном из них не анализировались отдельные клетки, что требуется для доказательства полипотентности.