Особенности дифференцировки эмбриональных стволовых клеток

Исходя из очевидных этических соображений, веро­ятно, никогда не представится возможность продемонстрировать колонизацию че­ловеческими эмбриональными стволовыми клетками всех тканей новорожденного после введения их в эмбрион хо­зяина. Потенциальные возможности развития эмбриональных стволовых клеток человека легко продемонстри­ровать путем введения этих клеток в организм животного — хозяина с иммуноде­фицитом. В этих условиях эмбриональные стволовые клетки формируют доброкачественную тератому, состо­ящую из невероятного спектра дифференцированных клеток.

Дифференцирован­ные клетки часто гистологически организованы в комплексные структуры, такие как ганглии. Важно отметить, что некоторые феномены никогда не наблюдаются в тератомассе. Например, ни осевой организации, ни сегментации будущего тела не наблюдается в тератомассе. Это подчеркивает важную биологическую разницу между эмбрионом и эмбриональными стволовыми клетками. Первый генерирует формирование схемы организма, а второй — нет.

Другая важная особенность эмбриональных стволовых клеток человека, полученных из тератомы, та, что эти клетки доброкачественные. Они не содержат ни недифференцированных стволовых клеток со свойствами эмбриональных раковых клеток, ни злокачественных производных другой недифференцированной ткани. Этим эмбриональные стволовые клетки человека отличаются от эмбриональных стволовых клеток мыши, так как трансплантат последних всегда содержит недифференцированную ткань в комбинации с дифференцированными клетками в тератоме.

Дифференциация эмбриональных стволовых клеток In vitro

Многие предположения о возможном использовании эмбриональных стволовых клеток человека основывались на гипотезе о вероятности получения чистых попу­ляций дифференцированных клеток из культур эмбриональных стволовых клеток. Для достижения этого не­обходимо подвергнуть эмбриональные стволовые клетки действию индуцирующих факторов, которые будут перестраивать их с высокой эффективностью в интересующий тип клеток. Прак­тически это не было доказано в системе эмбриональных стволовых клеток мышей.

Систематические исследо­вания в этом направлении начали проводиться примерно пять лет назад. При этом развивались в разных направлениях. В самом простом варианте полагались на спонтанную дифференцировку для развития необходимого клеточного типа. Спон­танная дифференцировка устанавливается случайно в культурах эмбриональных стволовых клеток и дает боль­шое разнообразие клеток, большинство из которых сложно охарактеризовать.

Похожая статья  Наркотическая зависимость: три основных принципа лечения наркомании, с чего начать помощь наркозависимому

Про­цесс спонтанной дифференцировки может быть ускорен при субоптимальных ус­ловиях самообновления стволовых клеток, но поддерживающих жизнедеятельность клеток. У мышей наиболее широко используется метод стимуляции дифференциации путем формирования эмбрионального тела. Есть несколько вариантов это­го подхода, но все они сводятся к культивированию эмбриональных стволовых клеток в суспензии в отсутствии адгезии или фидерного слоя фибробластов, или LIF. В этих условиях эмбриональные стволовые клетки фор­мируют компактное тело, состоящее из двух слоев:

· внешний слой клеток со свой­ствами экстраэмбриональной эндодермы — клеточный слой, формирующий ос­нову бластоцисты,
· внутренний слой, который представлен плюрипотентными клетками.

Эмбриональные тела обычно перенасыщают монослойную культуру и внутри их идет дифференцировка клеток. Во многих исследованиях получали эмбриональные тела из эмбриональных стволовых клеток и эмбриональных половых клеток че­ловека для индукции дифференцировки и из них — различные клетки. Неясно до конца, что формирует в этих структурах внешний слой экстраэмбриональной эндодермы, но в них есть клетки, которые экспрессируют маркеры этой ткани.

Указанная технология приводила к смешиванию различных клеточных типов, поэтому исследователи разрабатывали разнообразные подходы для увеличения «урожая» конкретных интересующих их типов клеток из культур. На культуры можно воздействовать специфическими факторами и агентами, которые направ­ляют дифференцировку в определенном предпочтительном направлении. Некоторые исследователи считают, что нет доказательств изменения выхода дифферен­цировки эмбриональные стволовые клетки под действием конкретного фактора. В то же время есть примеры влияния фактора, приводящего к сильному изменению в сторону предпочтения одного специфического направления дифференцировки.

Описаны различные способы селекции определенных типов клеток, включая селекцию на основе экспрессируемых поверхностных маркеров или сортировки активно флюоресцирующих клеток. Разработаны методы селекции в культурах, когда стимулируется рост одного конкретного типа клеток за счет другого. Путем генетической модификации стволовых клеток селектирующий маркер вводится под контроль фактора транскрипции, который включается при специфической дифференциров­ке клеток. Селектируемый маркер экспрессируется в клетках, подвергшихся диф­ференцировке в нужном направлении, и селекционный агент уничтожает другие типы клеток в культуре.

Похожая статья  Джаред Даймонд: «Почему богатство и могущество оказались распределены так...»

В конечном итоге, какой бы методический подход не использовался, в культу­ре клеток должны быть созданы условия, достаточные для поддержания выжива­ния и роста как исходных стволовых клеток, так и определенных типов конечных клеток.

Многочисленные исследования показали дифференциацию эмбриональных стволовых клеток человека In vitro. Reubinoff et al. (2000) установили, что при условиях, ограничивающих рост стволовых клеток, но угнетающих экстраэмбриональную дифференциацию, эмбриональные стволовые клетки давали начало клеткам, экспрессирующим маркеры различных дифференцированных линий. Эта дифференциация наблюдалась в монослойных культурах, давших в течение недель высокую плотность, из-за чего сформировался многослой клеток.

В данных условиях с высокой частотой наблюдается нейронная дифференциация клеток и при тщательных исследованиях идентифицируются клетки-предшественники, которые давали начало нейронам. Эти клетки-предшественники отделяли, разру­шали и возвращали в культуральную среду, поддерживающую рост стволовых нервных клеток, после чего в таких культурах формировались нейросферы (ок­руглые скопления стволовых нервных клеток), клетки которых дифференциро­вались в клетки, имеющие свойства нейронов. Исследования показали, что вве­дение этих предшественников в мозг новорожденной мыши ведет к дифференци­ровке их во все типы клеток нервной ткани.

Данные исследования свидетельствуют, что через «природную селекцию» — селекцию, достигнутую путем использования условий культуральной среды, по­кровительствующих росту одного типа клеток, — можно получить чистые попу­ляции исходных клеток. Пока не совсем ясно, имеют ли исходные стволовые клетки свойства, близкие к свойствам стволовых нервных клеток, выделенных из эмбриональной, фетальной или взрослой центральной нервной системы. По некоторым данным, исходные эмбриональные стволовые клетки имеют бо­лее выраженную пластичность в развитии, чем аналогичные фетальные или взрос­лые стволовые клетки.

Во многих исследованиях формирование эмбриональных телец использовали для индукции диф­ференцировки эмбриональных стволовых клеток человека. Метод включает перенос культуры эмбриональных стволовых клеток человека высокой плотности на бактериологические чашки для индукции агрегации без суб­стратной адгезии. По прошествии нескольких недель агрегаты приобретали фор­му пузырей.

Похожая статья  Длина теломер у человека: уменьшение длины теломер Т-клеток, количество гемопоэтических стволовых клеток

На первой стадии этих исследований эмбриональные стволовые клетки человека использовалась гибридизация In situ и RT-PCR и была выявлена экспрессия транскриптов α-фетопротеина, γ-глобулина, белка нейрофиламента (68 кЕ) и сердечного актина. В некоторых эмбриональных телах наблюдались сокращающиеся кардиомиоциты. Следует отметить, что эмбриональные тельца как изучаемые структуры в этих исследованиях по своей морфологии не сравнимы с какой-либо стадией эмбрионального развития человека. Shamblott et al. (1998) установили, что эмбриональные половые клетки человека могут формировать эмбриоидные тельца, в которых диф­ференцируются различные клеточные типы.

При исследовании спонтанной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека в культурах In vitro показано, что они могут давать, кроме нейронов, несколько клинически зна­чимых типов клеток. Так, по данным Assady et al. (2001), Kehat et al. (2001), эмбриональные стволовые клетки человека линии H9 могут давать начало инсулинпродуцирующим клеткам и кардиомиоцитам. Инсулинпродуцирующие клетки образуются в культуре эмбриональных стволовых клеток в от­сутствии фидерного слоя в монослое или в эмбриональном тельце. Продукция инсулина в меньшин­стве клеток была подтверждена RT-PCR, иммуноокрашиванием и определением инсулина в надосадочной жидкости, но количество инсулина не соответствовало уровню глюкозы. С помощью RT-PCR определено, что экспрессируются и дру­гие маркеры ранней панкреатической дифференцировки.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

*

code