Мишени ген-модифицированных стволовых клеток для терапевтических целей: генотерапия, экспрессия генов

По мере продвижения этих исследований расширяется понимание природы стромальных стволовых клеток, что ускоряет их практическое использование с генетическими исправлениями или без них в клинической практике.

Генотерапия — еще одно важное направление, позволяющее обойти ограниче­ния при пренатальной аллотрансплантациистволовые клетки. Кроветворные стволовые клетки привлекают внимание как объект, принима­ющий участие в генотерапии соматических клеток. Связано это с тем, что они спо­собны на протяжении всей жизни донора продуцировать потомство клеток, кото­рые содержат «терапевтический» ген. В настоящее время в постнатальной терапии детей с генетическими заболеваниями применяются Ex vivo ретровирусная трансдукция лимфоцитов, KCix или клеток-предшественников, полученных из костного мозга у мозга или пуповинной крови, с последующей аутотрансплантацией реконструи­рованных клеток в организм пациента.

Первые испытания этой технологии показали возможность выполнения генотерапии и ее безопасность при использовании клеток из пуповинной крови у боль­ных с аденозиндезаминазной недостаточностью. По данным отдельных результа­тов, клиническая эффективность этой процедуры была крайне ограниченной. Кли­нически успешная генотерапия наблюдалась (оценка проводилась через 10 месяцев) при тяжелом комбинированном иммунодефиците, сцепленном с Х-хромосомой. При этом использовали аутологичные клетки CD34+ костного мозга, трансдуци­рованные ретровирусом.

Для внедрения генотерапии в широкую клиническую практику еще необходи­мо преодолеть определенные препятствия. В первую очередь они связаны с эффек­тивностью трансдукции: случайной интеграцией генной инженерной конструкции «генный вектор» в геном хозяина; продолжительностью экспрессии «терапевти­ческого» гена («молчание гена»); иммунным ответом хозяина, направленным про­тив вектора, гена или генного продукта; воспроизводимой продукцией безопасных, насыщенных, беспрепятственно реплицируемых векторов.

Экспрессия генов может нарушиться в результате спонтанного прекращения активности регуляторной последовательности, контролирующей экспрессию гена; в результате инактивации промоторов в трансдуцированной клетке-хозяине; под воздействием специфичных защитных механизмов хозяина или устранения транс — дуцированных клеток иммунной системой хозяина после распознавания чужерод­ного генного продукта. Так, установлено, что воспалительные цитокины (ФНОа, уИФН) непосредственно подавляют экспрессию трансгенов, хотя они могут дей­ствовать и через иммунные реакции хозяина против «чужого».
Некоторых успехов удалось достичь в модельной системе мыши, однако в мо­дельных системах других животных, где наблюдалось успешное приживление ге­нетически модифицированных аутологичных кроветворные стволовые клетки или клеток-предшественников, экспрессия гена In vivo все-таки значительно нарушена.

Похожая статья  Санаторно-курортное лечение детей с заболеваниями сердца

Мишени ген-модифицированных стволовых клеток для терапевтических целей

Трудности вызываются и затруднениями в идентификации мишеней, перено­сящих гены (кроветворные стволовые клетки), так как единых маркеров для стволовых клеток не существу­ет. Скорее всего они представляют гетерогенную популяцию. Важной проблемой является выбор системы переноса генов в кроветворные стволовые клетки. В настоя­щее время используются ретровирусные и аденовирусные, аденоассоциированные, лентивирусные векторы и липосомные векторы невирусной природы.

На модельных системах мыши и собаки апробировано поколение аденоассоциированных вирусных векторов. После внутримышечной или внутрипеченочной инъекции они обеспечивали длительную экспрессию гена с устранением у них ге­мофилии. В отличие от аденовирусов, ретровирусы способны стабильно встраи­ваться в геном хозяина, если клетки активно делятся, поэтому их применяют чаще для доставки гена в кроветворные стволовые клетки. Однако ретровирусные векторы неэффективны для пе­реноса генов в неделящиеся клетки. Для решения этой проблемы делаются попыт­ки применить новые технологии устойчивой ретровирусной трансляции.

Исполь­зуют, например, предварительную стимуляцию ранее не применявшимися фак­торами роста (тромбопоэтином) и лигандом At3; центрифугирование или трансдукцию на фрагментах фибронектина. Разработаны также лентивирусные векторные системы на основе ВИЧ с репликационной недостаточностью, которые стабильно интегрируются в геном как делящихся, так и неделящихся клеток хозяина, в том числе и в геном кроветворных стволовых клеток плода. Предполагается, что с помощью этих векторов удается осуществить длительную, стабильную трансдукцию кроветворных стволовых клеток и их потомства.

Высокочувствительной к генной трансдукции является развивающаяся крове­творная система плода, которая имеет несколько особенностей, полезных для пе­реноса генов:

· высокий пролиферативный статус,

· экспансия пула стволовых кле­ток,

· небольшое количество необходимых генноинженерных стволовых клеток,

· отсутствие иммун­ного ответа, направленного на вектор, после переноса гена в предварительно сен­сибилизированный плод.

Похожая статья  Морфологические и поведенческие эффекты трансплантации нейральных стволовых клеток: амфетаминовые пробы

Все это позволяет избежать прерывания экспрессии гена и повреждения тканей. Установлено также, что стволовые клетки из пуповинной крови плода обладает высоким потенциалом экспансии и более выраженной возможностью рет­ровирусной трансдукции по сравнению с клетками взрослого организма. Экспе­рименты по трансплантации стволовых клеток в бластоцисту мыши показали, что экспрессия гена в донорских клетках в значительной степени зависит от стадии развития мик­роокружения хозяина. Это указывает на большую эффективность пренатальной генотерапии.

Для внутриутробного переноса генов в различные клетки и органы разработаны модели, в том числе и для эпителиальных клеток легких, гепатоцитов, клеток кожи, кишечника, сердца. Введение конструкций «вектор-ген» в мо­дельных системах включает интраамниотический, интратрахеальный, интраперитонеальный, интрапеченочный, интрасосудистый, интраплацентарный способы. Возможен также трансплацентарный перенос генноинженерных конструкций пос­ле введения ее в кровоток материнского организма, но он не применяется у чело­века из-за высокого риска трансдукции материнского организма.

Во избежание такого нежелательного эффекта предложен альтернативный подход, заключаю­щийся в том, что производится направленная доставка вектора в плацентарную ткань, а не в кроветворные клетки. Положительный результат был получен в опы­тах на грызунах. Аутологичные клетки трофобласта выделялись из плаценты, гене­тически изменялись In vitro и ретрансплантировались в плаценту in utero. Эти клет­ки выживали и экспрессировали генные продукты, обнаруженные в циркулирую­щей крови плода.

В настоящее время перенос генов в кроветворные стволовые клетки плода разрабатывается в двух направ­лениях: генотерапия Ex vivo И генотерапия In vivo.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

*

code