Механизмы нейрогенеза, характеристика стволовых клеток

В развивающейся центральной нервной системе стволовые клетки нервной трубки дают начало клет­кам трех типов:

· нейронам,
· астроцитам,
· олигодендроцитам.

Эти стволовые клетки характеризу­ются вытянутым телом и контактами с внутренней и наружной поверхностями эпителиоподобного клеточного слоя. Полагают, что они дают три разных типа кле­ток с наличием полустволовых клеток, о которых говорил еще В. Гис в конце XIX века. Исследования, проведенные на дрозофиле, указывают на существование стволо­вых клеток, при асимметричном митозе которых образуются нейроны и астроциты. При изучении клеточных линий у млекопитающих вначале сложилось мнение, что для нейронов и астроглии существуют различные предшественники. В последующем многочисленные работы показали развитие нейронов и нейроглии из одной клетки-предшественника.

В эктодермальном пласте дифференцировка нейральных предшественников контролрфуется сигнальными путями, связанными с регуляторными генами из семейства спираль — петля — спираль (bHLH). Пронейральные bHLH гены вклю­чают три группы генов дрозофилы:

· achaete,
· lethal scute,

Которые относятся к Drosophila Achaete Scute gene Complex, несвязанного с этим семейством гена atonal и их многочисленных аналогов у других видов, в том числе млекопитаю­щих. Экспрессия этих генов приводит к появлению кластеров клеток, кото­рые могут дифференцироваться в нейральные предшественники. Механизмы ак­тивации генов до корща неясны. В эту группу генов входят также гены семейства bHLH, в частности, такие как asense дрозофилы и neuro D лягушки Xenopus.

Экспрессия рецепторных трансмембранных белков семейства Notch, которые при контакте с лигандом блокируют экспрессию пронейроиальных bHLH-генов. ограничивает реализацию нейрональной детерминации. Лигандами рецеп­торов Notch служат трансмембранные белки Delta соседних клеток. Полагают, что внеклеточный домен Delta, образующийся при расщеплении молекулы, также может выполнять роль лиганда в растворенном виде. Но основное значение в реализации дальнейшей судьбы клетки имеют прямые межклеточные контак­ты.

Роль контактной индукции наглядно продемонстрирована в культу­ре стволовых клеток. При высокой плотности роста наблюдалось образование только астроцитов и гладкомышечных клеток. Предполагалось, что главную роль в механизмах подобной «трансдифференцировки» играют белки семейств Notch и Wnt/Frizzled. Сигнальное значение последних показано на примере клеток нервного гребня. Так, связывание Notch с лигандом приводит к ферментно­му отсоединению внутриклеточной части Notch, которая мигрирует в ядро и вы­полняет роль коактиватора белка Su (Н), являющегося транскрипционным фак­тором. Последний активирует гены семейства HES (у позвоночных), Е (spl) — у насекомых. Продукты этих генов репрессируют пронейрональные гены bHLH, пре­пятствуя реализации нейрональных потенций клетки.

В исследованиях, проведенных In vitro, были вскрыты механизмы регуляции стволовых клеток. Установлено, например, что фактор роста фибробластов 2 (ФРФ2) является митогеном для нейральных предшественников из гиппокампа эмбрионов крысы. Еще одним митогеном стволовых нейрональных клеток из стриатума является эпидермальный фактор роста (ЭФР). И ФРФ 2, и ЭФР поддерживают рост недифференцированных предшественников в культуре. При удалении их из культуральной среды останавливается размножение клеток, ко­торые начинают дифференцироваться и дают начало нейронам, астроцитам и олигодендробластам.

Эти же ростовые факторы являются митогенами для стволовых клеток в других тканях, что, возможно, связано с определенной гомологичностью стволовых клеток разных тканей. В процессе культивирования клеток из головного мозга мыши в среде с ЭФР клетки отделялись от подлежащего слоя и формировали нейросферы — компакт­ные агрегаты полипотентных клеток, дающих начало нейронам, астроцитам и олигодендроцитам или новой нейросфере после пролиферации. Для кле­ток нейросфер характерными фенотипическими признаками является полная за­висимость от ЭФР и трансформирующего фактора роста альфа (TGFa), экспрес­сия белка промежуточных филаментов нестина и рецепторов ЭФР.

Взаимодействие сигналов нейронов и глии определяет направление дифференцировки трансплантируемых клеток

Из эмбриональной ткани мозга, а затем и из зрелого головного мозга была по­лучена другая популяция стволовых клеток, абсолютно зависимая от ФРФ2. Эти стволовые клетки обнаруживаются раньше ЭФР-зависимых нейросфер. ФРФ2- зависимые клетки образуют больше нейронов в течение многих пассажей.
Предполагается, что две указанные группы клеток — независимые популяции стволовых клеток, которые могут присутствовать в одной и той же области мозга. Но есть дан­ные, указывающие на то, что ФРФ2-зависимые клетки — предшественники ЭФР — зависимых клеток нейросфер.

Важным является вопрос о поддержании митотической активности стволовых клеток во вре­мени в культуре In vitro. По данным многих, хотя и противоречивых результатов, для нервной стволовой клетки предел Хейфлика пока не достижим в эксперименте. В первых исследованиях было установлено, что стволовые клетки в нейросферах сохраняли свои свойства на протяжении 7 месяцев при 8 пассажах. Оказалось, что в поддержании жизне­способности нейросфер имеет значение способ их дисперсии при каждом пасса­же.

Пассажирование нейросфер необходимо, так как превышение ими определен­ных размеров приводит к гибели клеток из-за снижения проникновения питательных веществ в центральные отделы нейросфер. Как трипсинизация или воздей­ствие другими литическими ферментами, так и механические воздействия, при­меняемые для диссоциации клеток, значительно снижают пролиферативную ак­тивность клеток из-за нарушения клеточных контактов. Разделение нейросфер из клеток человека на четыре части значительно повышало жизнеспособность клеток при пассажировании.

Метод позволил поддерживать культуру стволовых нервных клеток человека до 300 дней. Все культуры прекращали митотическую активность между 250-300 сутками культивирования и претерпевали дегенератив­ные изменения или начинали дифференцировку в нейроны или астроциты. Ко­личество митозов в среднем составляло 30 и, вероятно, соответствовало пределу для стволовых нервных клеток. Астроциты человека поддерживают жизне­способность в течение 40 митозов. Прекращение митотической активности в куль­туре нервных стволовых клеток — значимый факт, свидетельствующий об отсутствии спонтанной онкогенетической трансформации клеток.

Похожая статья  Из чего состоит механизм музыкальной шкатулки: валик, пианолы

Культуры стволовых нейральных клеток отличались способностью формиро­вать большое количество нейронов (более 40 % Всех дифференцированных клеток) в течение 150 дней культивирования, что принципиально отличается от нейросфер, полученных от мышей и крыс, дающих не более 5 и 1 % Нейронов соответственно даже на ранних пассажах. В отличие от нейросфер грызунов, нейросферы челове­ка формировали гораздо меньше олигодендроцитов, что имеет важное значение, учитывая перспективы клеточной терапии демиелинизирующих заболеваний. При добавлении культуральной среды В104 значительно повышалось образова­ние олигодендроцитов.

Подавляющее количество формирующихся нейронов у грызунов и человека является ГАМК-ергическими. Дофаминергические нейроны, необходимые для ле­чения болезни Паркинсона, образуются из клеток-предшественников, выделенных из развивающегося мозга грызунов только при первых пассажах. Дальнейшее пассажирование клеток приводит к образованию исключительно ГАМК-ергических клеток. Индуцирующими факторами дофаминергических нейронов у грызу­нов являются ИЛ-1 и ИЛ-11, фрагменты мембран клеток, лейкозингибирующий фактор (LIF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF). Аналогичный методический подход в отношении клеток человека, к сожалению, не позволяет получить дофаминергические нейроны при длительном пассажировании.

В течение всего пренатального периода происходит развитие мозга и в нем про­должается нейрогенез. В эти сроки нейроэпителий нервной трубки формирует многослойную структуру. Полученные результаты свидетельствуют, что источни­ком новых нейронов в это время является радиальная глия, представленная вы­тянутыми клетками с длинными отростками, которые имеют радиальное направ­ление по отношению к стенке мозговых пузырей и контактируют с внутренней поверхностью желудочков и наружной пиальной поверхностью стенки мозга.

Обычно радиальная глия рассматривалась как механический остов, необходимый для миграции нейробластов из вентральной области в поверхностные отделы и формирования правильной ламинарной организации коры. В процессе развития радиальная глия трансдифференцируется в астроциты. У млекопитающих боль­шая часть радиальной глии исчезает в ранние сроки после рождения. У других животных радиальная глия сохраняется до зрелого возраста и, как правило, ней­рогенез у них активно продолжается в постнатальном периоде. В более поздние сроки эмбриогенеза (18-е сутки) дифференцировка направлялась в сто­рону астроцитов, при этом образование нейронов уменьшалось. При маркировке радиальной глии In situ путем введения в полость мозговых пузырей 15-16-суточных зародышей крысы ретровируса, связанного с зеленым флуоресцирующим бел­ком (ЗФБ), исследователям удалось наблюдать динамику асимметричного деле­ния клетки радиальной глии с образованием дочерней клетки, имеющей имму­нологические и электрофизиологические характеристики нейробласта. Об­разовавшиеся нейробласты использовали материнскую клетку радиальной глии для своей миграции к пиальной поверхности.

Белок промежуточных филаментов — нестин — является маркером радиаль­ной глии. С помощью метода флуоресцентной проточной сортировки клеток, ме­ченых ретровирусом, связанным с ЗФБ, который экспрессируется под контролем нестина, было установлено, что стволовые клетки гиппокампа (области зубчатой извилины и хи­муса) человека (материал был получен при операциях по поводу эпилепсии) яв­ляются нестинэкспрессирующими. Следовательно, их можно рассматривать как радиальную глию. У человека, как и у других млекопитающих, радиальная глия сохраняется в зубчатой извилине.

Идентификацию стволовых клеток до их культивирования проводят на скрининге антигенов стволовых клеток, в частности кроветворения, и выбирают те из них, которые соответствуют нейральным стволовым клеткам. С помощью этого метода определены маркеры для проточной сор­тировки (CD133+, 5Т12+, CD34, CD45, CD24) и получены клетки, образующие In vitro нейросферы и способные дифференцироваться в нейроны при пересадке в головной мозг поврежденных мышей с иммунодефицитом.

Источниками новых нейронов в зрелом головном мозге млекопитающих и че­ловека, по общему мнению, служат субвентрикулярная зона (нейроны обонятель­ных луковиц) и зубчатая извилина гиппокампа (клетки-зерна). Стволовыми клет­ками в обеих областях являются клетки, которые экспрессируют глиальный кис­лый фибриллярный белок (ГКФБ). Так как ГКФБ был выявлен толь­ко в астроцитах, следовательно, в зрелой центральной нервной системе этот тип клеток включает нервные стволовые клетки. Это было доказано на трансгенных мышах, экспрессирующих рецепторы ретровируса птичьего лейкоза под контролем ГКФБ.

Нейроны, происходящие из ГКФБ-положительных предшественников, были обнаружены в обонятельных луковицах и зубчатой извилине. Эти результаты противоречат представлению о том, что в этой области мозга стволовыми являются клетки радиальной глии, которая не экспрессирует ГКФБ в зубчатой извилине в зрелом возрасте. Возможно, речь идет о двух популяциях стволовых клеток или же имеет место несовершенная иммунологическая диагнос­тика In situ.
Вопрос о локализации стволовых клеток в субвентрикулярной зоне остается до конца нере­шенным.

По одним данным, эпендимные клетки способны образовывать в куль­туре сферические клоны, но не «истинные» нейросферы, и дифференцироваться только в астроциты. В то же время получены убедительные доказательства лока­лизации нервных стволовых клеток в эпендимном слое. Маркировка клеток эпендимы флуоресцентным красителем Dil и/или LacZ вирусами показала присутствие маркера в клетках суб — эпендимиого слоя и обонятельных луковиц. Эти клетки способны формировать нейросферы In vitro и дифференцироваться в нейроны, астроциты и олигодендро­циты.

Часть (5%) клеток эпендимы проявляют признаки стволовых клеток и экспресси­руют их маркеры:

· Nestin,
· Notch 1,
· Mussashi 1.

Похожая статья  Увлекательные бесплатные игры «Том и Джерри» для детей любого возраста

Предполагается, что в основе механизма асимметричного митоза лежит неравномерное распределение Notch 1 в плазматической мембране клеток. Этот рецептор находится только в дочерней клетке, остающейся в эпендимном слое. Вторая клетка, мигрирующая в субэпендимный слой, не содержит Notch 1. По другим данным, в каудальных отде­лах субвентрикулярной зоны образуются лишь глиальные клетки, а источником нейронов служат только рострально-латеральные отделы. Не исключаются оди­наковые нейрогенные потенции передних и задних отделов субвентрикулярной зоны боковых желудочков. В субвентрикулярной зоне различают три основных типа нейральных предшественников: А, В и С.

А-клетки экспрессируют связан­ную с сиаловой кислотой молекулу клеточной адгезии нейронов (PSA-NCAM) и одну из молекулярных форм тубулина — Tub 1. Тяжи из А-клеток окружены В-клетками, которые экспрессируют ГКФБ и несут антигенные признаки астроцитов. У С-клеток нет антигенных признаков нейронов и глии, они характеризу­ются высокой пролиферативной активностью. На трансгенных животных и мето­дом трансфекции клеток эпендимы ретровирусом показано, что предшественни­ком А-клеток и в последующем нейронов обонятельных луковиц являются В-клетки.

Взаимоотношение между А — и В-клетками в ходе миграции сохраняется. Ок­ружают тяжи предшественников нейронов ГКФБ-позитивные глиальные клет­ки. Такой характер миграции принципиально отличается от перемещения постмитотических нейробластов по радиальной глие в развивающемся мозгу. В процессе миграции оба типа клеток вступают в митозы и по достижении обо­нятельных луковиц внедряются в слой зернистых клеток и в клубочковый слой.

На основании изучения нервных стволовых клеток головного мозга высказана гипотеза о существо­вании линии стволовых клеток в онтогенезе головного мозга. На ранних этапах развития мозга стволовой клеткой является клетка нейроэпителия; по мере созревания она трансдифференцируется в радиальную глию, а в зрелом мозге роль стволовых клеток выполняют клетки, которые имеют признаки астроцитов. Гипотеза, несмотря на свою простоту и четкость, имеет ряд спорных вопросов. Например, противоречие в отношении стволовых клеток гиппокампа. Она не касается глубоких отделов мозга, которые не имеют слои­стого строения, как кора, и развиваются, в частности из таламических бугров, где радиальная глия отсутствует.

Детерминация и последующая дифференцировка нервных стволовых клеток находится под влияни­ем факторов ми кроокружения. Роль этих факторов на реализации потенций стволовых клеток продемонстрирована при трансплантации стволовых клеток из зрелого спинного мозга крысы в разные отделы зрелой нервной системы. Так, при пересадке в спинной мозг и об­ласть аммонова рога формировались только астроциты и олигодендроциты, а при введении клеток в зубчатую извилину образовывались не только глиальные клет­ки, но и нейроны. При имплантации в зубчатую извилину или в область мигра­ции нейронов обонятельных луковиц, наоборот, наблюдались активная миграция клеток и образование многочисленных нейронов.

Поскольку вновь образованные нейроны локализуются в одном из ключевых мест в гиппокампе и могут участвовать в реализации его функций, связанных с памятью и обучением, то одно из центральных мест в нейрогенезе занимает выяс­нение закономерностей, которые определяют деление, дифференцировку и гибель клеток в зубчатой извилине гиппокампа.

BrdU — иммунеположительные клетки, образующие небольшое скопления из 2-5 клеток в субгранулярной зоне на границе зубчатой извилины и хилуса. Это косвенно свидетельствует о наличии между ними щелевых контактов, определяющих судьбу не только в антенаталь­ном периоде, но и в зрелом возрасте. У взрослой крысы количество делящих­ся клеток в зубчатой извилине может достигать нескольких тысяч в сутки, что со­ответствует долям процента от общего количества присутствующих здесь клеток-зерен. Нейроны составляют 50-90 % Клеток, глиальные клетки (в основном астроциты) — до 15 %, остальные — клетки без антигенных признаков нейронов и глии.

Исследование этих неидентифицированных клеток показало, что мно­гие из них содержали антигены эндотелиальных клеток. Их часто обнаруживали в виде групп делящихся клеток вблизи кровеносных сосудов. Результаты данных исследований послужили основой для гипотезы о тесной взаимосвязи нейрогенеза и ангиогенеза в зубчатой извилине. Опыты In vitro указывают на возможность поддержания дифференцировки, но не пролиферации предшественников нейро­нов со стороны эндотелиальных клеток, что, вероятно, реализуется за счет их спо­собности синтезировать мозговой нейротрофический фактор (BDNF).

Предшественники клеток-зерен по мере дифференцировки мигрируют в зуб­чатую извилину и образуют отростки, которые растут в сторону зоны САЗ аммонова рога, где формируют синапсы с пирамидными глутаматергическими и вста­вочными тормозными нейронами. Вновь образованные клетки-зерна встра­иваются в существующие нейронные цепи в течение 2 недель, а первые синапсы фор­мируются уже на 4-6-е сутки после появления новых клеток. Наряду с цитогенезом наблюдается гибель клеток преимущественно путем апопгоза.

Большинство клеток-зерен в зубчатой извилине грызунов образуются в пер­вые две недели после рождения. С возрастом их количество постепенно снижает­ся, но даже у старых животных сохраняются делящиеся нейрогенные предшествен­ники. В субвентрикулярной зоне, в отличие от нейрогенеза в зубчатой извилине, интенсивность образования нейронов с возрастом не снижается.

Большое количество меченых нейронов и астроцитов выявлялось не только в зубчатой извилине, но и в аммоновом роге при более частом введении взрослым животным Brd U или 3Н-тимидина, что свидетельствует о возможности образо­вания новых нейронов и в других областях гиппокампа.

Как было многократно показано, в культуре In vitro клетки могут дифферен­цироваться и расширять свои потенции. Косвенно об этом свидетельствуют дан­ные о развитии нервных стволовых клеток мышей в костном мозге при параллельном формировании зрелых клеток крови. При пересадке генетически меченых (Lac Z) и способ­ных образовывать нейросферы стволовых клеток из зрелого или эмбрионального мозга в голов­ной мозг облученных мышей с угнетенным кроветворным ростком были получе­ны весьма интересные данные. Стволовые клетки давали начало не только нейрональным производным, но и клеткам крови. Это говорит о высокой полипотентности нервные стволовые клетки, реализуемой за пределами головного мозга.

Похожая статья  Напиток Кока-кола: вред и польза, при каких заболеваниях запрещается употреблять, Кока-кола и ментос (мятная конфета)

Нервная стволовая клетка может дифференцироваться в клетки крови под влиянием микроокружения костного мозга, переходить в кроветворные стволовые клетки или в более примитивную нейральную/кроветворную стволовую клетку. При введении кроветворных стволовых клеток из костного мозга генетически модифицированным мышам в головной мозг было установлено, что кроветворные стволовые клетки в новом микроокружении тка­ни мозга дифференцируются в глиальные и нервные клетки. Возможно, в бу­дущем это один из обнадеживающих вариантов клеточной терапии при патологи­ческой гибели нейронов. Отмечено, что у крысы морфогенез зубчатой извилины протекает в так называемый период отсутствия ответа на стресс (первые две неде­ли постнатального развития), когда значительно снижается выработка гормонов корой надпочечников.

Стероидные гормоны надпочечников влияют также на миграцию клеток-зерен и тормозят вступление клеток в апоптоз. Новые нейроны не встраиваются в зер­нистый слой зубчатой извилины, а остаются в хилусе. Вероятно, одновременно на­рушается формирование синаптических связей.

Влияние гормонов, скорее всего, имеет непрямой характер. Об этом свидетель­ствует отсутствие или очень слабая экспрессия рецепторов минералокортикоидов (тип I) или глюкокортикоидов (тип И) в пролиферирующих клетках-зернах не только у зрелых животных, но и в ходе развития зубчатой извилины. Среди всех нейронов головного мозга нейроны гиппокампа характеризуются наиболее высо­ким содержанием рецепторов глюкокортикоидов.

Влияние глюкокортикоидов на нейрогенез в зубчатой извилине — важное зве­но стрессовых воздействий на гиппокамп. Хронический стресс снижает спо­собность животных к усвоению новых навыков и обучению. Наблюдается более выраженный отрицательный эффект на нейрогенез, чем при остром стрессе. При иммобилизации беременных крыс установлено, что стресс в пренатальном возрасте крысят снижает количество клеток в зубчатой извилине и угнетает нейрогенез. Интенсивность нейрогенеза отмечалась в группах крыс с разной ответной реакцией на смену обстановки. В группе сильно реагирующих животных (повышение двигательной активности) нейрогенез был ниже, чем у животных со слабой реакцией, что хорошо коррелировало с весом надпочечников и уровнем глю­кокортикоидов в крови.

Снижение нейрогенеза, перестройка нейронов, межнейронных связей и гибель нервных клеток являются морфологическим базисом генеза депрессивных состоя­ний, в котором глюкокортикоиды имеют определенное значение, а антидепрессив­ная терапия активирует нейрогенез. На основании этих данных базируется гипо­теза о связи между процессом образования новых нейронов в гиппокампе и раз­витием депрессии.

Повышение содержания глюкокортикоидов и снижение эстрогенов с увеличе­нием возраста животных может угнетать нейрогенез и активность центральной нервной системы. В пользу этого предположения свидетельствует активация нейрогенеза при удалении над­почечников у старых крыс.

Среди других гормонов, влияющих на нейрогенез, важное значение имеют эс­трогены. Они — антагонисты глюкокортикоидов: поддерживают пролиферацию и, возможно, выживание предшественников, а также значительно улучшают обучае­мость животных. О влиянии эстрогенов свидетельствуют циклические изменения в количестве клеток-зерен, большее количество этих клеток у самок по сравнению с самцами.

Важное значение имеет исследование влияния внешних сигналов, прежде все­го митогенов и факторов роста, на нервные стволовые клетк. Выше упоминалось о роли в нейрогенезе ЭФР, ФРФ и BDNF. Установлено также, что тромбоцитарный фактор роста PDGF поддерживает нейральную дифференцировку предшественников, а цилиарный нейротрофический фактор (CNTF) и трийодтиронин вызывают образование пре­имущественно астроцитов и олигодендроцитов. Аденилатциклазаактивирующий белок гипофиза (РАСАР) и вазоактивный интестинальный пептид стимулируют пролиферацию нейральных предшественников и сдерживают дифференцировку дочерних клеток.

Длительное воздействие опиатов существенно угнетает нейрогенез. Этот эффект не опосредован глюкокортикоидами. Он ярко выражен у адреналэктомированных животных с искусственно регулируемым уровнем глюкокортикоидов. Опиатных рецепторов у нейральных предшественников в зубчатой извилине не установле­но, но они обнаружены в дифференцирующихся нейронах в эмбриональном пе­риоде, поэтому судить о прямом или опосредованном влиянии опиатов не пред­ставляется возможным.

По имеющимся данным, функциональная нагрузка на нервные центры, ответ­ственные за различение запахов, сказывается на образовании новых нейронов. За­крытие носовых ходов у крыс приводило к снижению количества вновь образо­ванных нейронов. У трансгенных мышей с дефицитом молекул адгезии нейронов наблюдалось снижение уровня нейрогенеза и количества мигрирующих в обоня­тельные луковицы нейронов и одновременно нарушалась способность различать запахи, хотя порог восприятия запаха и кратковременная память на запах не на­рушались.

Возбуждение клеток зубчатой извилины имеет важное значение в регуляции нейрогенеза. Например, снижение эффекта воздействия глутамата на клетки-зер­на после разрушения энториальной коры способствует пролиферации и диффе­ренцировке нейронов, а стимуляция волокон перфорантного пути, основного аф­ферентного входа в гиппокамп, приводит к торможению нейрогенеза.

Антагонисты NMDA-рецепторов поддерживают нейрогенез, а агонисты тормозят его. Агонисты NMDA-рецепторов оказывают сходное с глюкокортикоидами дей­ствие. На основании этого предполагается участие NMDA-рецепторов в реализации воздействия стероидных гормонов коры надпочечников на нейрогенез.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

*

code