Функциональные молекулы и возможные пути их связи с плюрипотентностью

На 3-5-й день эмбрионального развития мышиный зародыш проходит свою первую дифференцировку на внутреннюю клеточную массу и трофоэктодерму. Трофоэктодерма представляет собой один слой эпителиальных мононуклеарных клеток, ограничи­вающий заполненную жидкостью полость — бластоцель, и находящуюся там компактную группу клеток внутренняя клеточная масса. Внутренняя клеточная масса дает начало как эм­бриону, так и экстраэмбриональным образованиям, таким как амнион, аллантоис, в то время как трофоэктодерма формирует исключительно слой трофобласта плаценты.

До имплантации новые клеточные образования дифференцируются на бластоцелическую поверхность внутренняя клеточная масса, примитивную энтодерму, которая также яв­ляется экстраэмбриональным клеточным типом, давая начало эндодермальным слоям желточного мешка. Трофоэктодерма дифференцируется задолго до имплан­тации. Трофоэктодерма, покрывающая внутренняя клеточная масса, продолжает пролиферировать и ста­новится диплоидным трофобластом плаценты, а клетки, удаленные от внутренняя клеточная масса, пре­кращают деление, но продолжают редуплицировать свою ДНК и превращаться в гигантские трофобластические клетки. Морфологические и молекулярные иссле­дования показали, что все три генерации характерны для поздней бластоцисты.

Схема строения 4-дневной бластоцисты: ВКМ — внутренняя клеточная масса, ПЭ — первичная энтодерма, Т — трофобласт, БЦ — бластоциста

Молекулярные механизмы этого расхождения до сих пор до конца не изучены. Известно, что POU-домен фактора транскрипции Oct4 (Pou5fl) необходим для развития внутренняя клеточная масса. Oct4 экспрессируется в процессе оогенеза и в доимплантационном периоде, затем рестриктируется для внутренней клеточной массы и стадии бластоцисты. Его экс­прессия проявляется снова в раннем эпибласте и сохраняется затем в зароды­шевых половых клетках. Это ключевой маркер плюрипотентных клеток. Пони­мание его роли в данных клетках позво­лит раскрыть механизм плюрипотентности. М4-мутантные эмбрионы внача­ле формируют бластоцисту, но не эксп­рессируют маркеры внутренняя клеточная масса и могут обра­зовывать клетки трофобласта только в культуре In vitro. Таким образом, Oct4 необходим только для развития внутренней клеточной массы.

Идентификация положительных ключевых регуляторов специфичности поколений клеток трофоэктодермы была менее успешной. Существует не­ сколько факторов транскрипции, таких как Mash2 гена bHLH, ген Cdx и Т-box ген Eomes, чьи паттерны экспрессируются обратно гену Oct4, т. е. они экспрессируются всеми клетками раннего эмбриона, но рестриктируются трофоэктодермой на стадии бластоцисты.

В то же время мутация этих генов в отдельно­сти не препятствует формированию трофоэктодермы. Mash2 необходим для более позднего развития плаценты, a Cdx2 и Eomes — для раннего развития трофобласта. Обе мутации блокируют развитие на стадии бластоцисты/предимплантации, что сказывается на пролиферации трофобласта. Тем не менее, начинается образование трофоэктодермы, следовательно, они не нужны на начальных этапах формирования трофоэктодермы.

Эмбриональные стволовые клетки. Во время эмбриогенеза In vivo внутренняя клеточная масса форми­рует на ранней стадии постимплантационный эпибласт, являющийся промежуточ­ным пулом плюрипотентных клеток, которые быстро дифференцируются в пер­вичные зародышевые листки при гаструляции. Присутствие самовоспроизводя­щихся плюрипотентных стволовых клеток In vivo очевидно, но их можно получить и In vitro при культивировании в присутствии цитокина LIF. Эти эмбриональные стволовые клетки могут существовать нео­граниченно долго в присутствии LIF и экспрессируют маркеры недифференци­рованной полипотентной стадии, в том числе Oct4.

При снижении действия LIF утрачивается регулирующее действие маркеров, таких как Oct4, клетки теряют способность к самовозобновлению и начинают дифференцироваться в ряд специ­ализированных клеток. Поколение химер агрегированных эмбриональные стволовые клетки и 8-клеточного эмбриона или после введения эмбриональные стволовые клетки в бластоцисту плюри-, но не тотипотентны. Хотя они и способны развиваться во все типы тканей, но вносят малый вклад в форми­рование трофоэктодермы и первичной эндодермы. Этот недостаток — основа изу­чения тетраплоидной комплементации, когда все производные из эмбриональные стволовые клетки клеток пло­да могут быть получены из агрегата эмбриональные стволовые клетки с 8-клеточным эмбрионом. Восьмиклеточные эмбрионы не производят эмбриональные линии, но могут образовывать трофоэктодерму и первичную эндодерму для поддержания развития эмбриона из эмбриональные стволовые клетки.

Путь, по которому воздействует сигнал LIF на поддержание самовозобновле­ния эмбриональных стволовых клеток довольно хорошо изучен. LIF подает сигнал через гетеродимеризацию двух рецепторов класса I цитокиновых рецепторов, низкоаффинный LIF — рецептор (LIF-R) и обычный gpl30. Достаточно гомодимеризации лишь gpl30 для управления пролиферацией эмбриональные стволовые клетки без привлечения LIF-R. При слиянии внекле­точного домена Г-КСФ рецептора (G-CSF-R) с трансмембранным и цитоплазматическим доменом gpl30, которые были трансфецированы в эмбриональные стволовые клетки, лишенные LIF-R, пролиферация клеток запускалась быстрее в присутствии Г-КСФ, чем LIF. Таким образом, удалось оценить сходную роль различных сигнальных путей с участием gpl30 в самовозобновлении эмбриональных стволовых клеток.

Цитоплазматический домен gpl30 содержит несколько остатков тирозина, ко­торые фосфорилируются JAK-ассоциированными киназами после лигандстимулированной димеризации. Эти четыре фосфорилированных тирозина были иден­тифицированы как сайты взаимодействия с SH2 доменом фактора транскрипции STAT3. Мутация 4 связывающих сайтов в конструкции G-CSF-R — gpl30 приво­дит к отмене БТАТЗ-активации и блокаде самовоспроизведения эмбриональные стволовые клетки. Доминант­ная отрицательная БТАТЗ-конструкция давала такой же эффект.

Функциональные молекулы и возможные пути их связи с плюрипотентностью

Стимуляция сигнального gpl30 в эмбриональные стволовые клетки также фосфорилирует SHP-2 и ведет к активации киназ митогенактивирующего протеина (MAP), EKR и EKR2 Однако, мутация Y118 — SHP-2 связующего сайта gpl30 не блокирует пролиферацию эмбриональные стволовые клетки при инкубации их в случае активации МАР-киназ. Угнетение SHP-2RAS — ERK-пути на самом деле приводит к преобладанию самовозобновления над диф­ференцировкой. Хотя сигнальный gpl30 может активировать МАР-киназы, такая активация обычно ассоциируется с сигнализацией рецептора тирозинкиназ (RTK). В процессе эмбриогенеза RTK-сигнализация важна для дифференциации и исхода морфогенеза при гаструляции.

Таким образом, блокирование активности МАР-киназ в эмбриональные стволовые клетки может тормозить путь дифференцировки, запускаемый сигналом МАР-киназ и косвенно сохранять свойства стволовых клеток.

Эти данные четко показывают роль gpl30-JAK-STAT3 проводящего пути в са­мовозобновлении эмбриональные стволовые клетки. Активации STAT3 также достаточно для поддержания стволовых клеток. Пока еще неясна роль LIF-пути в развитии эмбриона In vivo. LIF экспрессируется в трофоэктодерме бластоцисты, а LIF-рецептор — во внутренней клеточной массе. Эти факты трудно объяснить, если учесть, что данный путь необходим для выживания плюрипотент — ной клетки In vivo. Тем не менее, ни LIF-мутанты, ни мутанты рецептора (LIF-R) и gpl30 не имели ни одного дефекта в развитии внутренняя клеточная масса или первичного эпибласта. Последние факты свидетельствуют о том, что LIF-проводящие пути необходимы для выживания внутренней клеточной массы при задержке имплантации. В процессе эволюции этот при­знак закрепился.

Стволовые клетки трофобласта. Состояние эмбриональных стволовых клеток зависит от баланса между ак­тивирующим сигналом STAT и репрессирующей сигнализацией МАР-киназ, так как самое малое изменение факторов роста способствует изоляции различных стволовых клеток из бластоцисты, в том числе и стволовые клетки трофобласта.

Стволовые клетки трофобласта можно выделить из бластоцисты или раннего постимплантационного трофобласта культивированием в присутствии фактора роста фибробластов (FGF) 4, гепарина и первичных эмбриональных фибробластов. В этих условиях эмбриональные стволовые клетки не развиваются, но можно выделить линии самовос­производящихся диплоидных эпителиоидных клеток. Эти клетки экспрессируют типичные для ранних диплоидных клеток трофобласта маркеры и полностью за­висят от FGF-сигналов для их пролиферации.

Удаление FGF повышает диффе­ренцировку клеток в сторону гигантских клеток. Добавление FGF неэффективно для пролиферации и дифференцировки. Как и эмбриональные стволовые клетки, в том числе и трофобласта также сохраняют спо­собность содействовать развитию нормальных тканей при введении их в ранний эмбрион. Между тем, стволовые клетки трофобласта развиваются только в клетки трофобласта плаценты, а не собственно плода. Они ведут себя как рестриктированные стволовые клетки, способные река­питулировать по пути дифференцировки линий трофобласта, но не способны да­вать начало другим типам клеток.

Стволовые клетки трофобласта нуждаются в активации МАР-киназ для их про­лиферации. Передача сигнала идет от связующего лиганда и активации FGF-peцептора; она сложная и вариабельная в различной пространственной и временной среде. Тем не менее, связывание рецептора и фосфорилирование сократительно­го белка FRS-2 — ключевые моменты, так как FRS-2 соединяет сигнальный FGF МАР-киназным путем.

Биохимические исследования стволовых клеток трофобласта, следующие за активацией, выявили фосфорилирование ключевых компонентов FRS-2- МАР-киназного пути. Такая активация необходима для сохранения стволовых клеток, так как угнетение МАР-киназы блокирует самовоспроизведение и запускает дифференцировку в гигантские клетки.

Эмбриональные стволовые клетки в трофобласте — простое переключение? Условия культивирования, которые активируют различные внутриклеточные сигнальные пути, приводят к изоляции и сохранению двух различных популяций стволовых клеток из бла­стоцисты мыши. Активация JAK-STAT-пути и угнетение МАР-киназных сигна­лов способствуют сохранению самовозобновления плюрипотентных стволовых клеток со свой­ствами, схожими с ранним эпибластом и экспрессией важного регулятора Oct4.

Активация сигнальных МАР-киназ, также как и активация рецептора FGF запус­кает пролиферацию рестриктированных стволовых клеток трофобласта с экспрессией ключевых регуляторов, таких как Cdx2 и Eomes. Эти две линии клеток морфологически и молекулярно различны, их потенциал In vivo весьма отличается. Они используют разные пути поддержания самообновления. Несмотря на происхождение из ран­него эмбриона, в котором клетки могут быть снова направлены по другим путям, эмбриональные стволовые клетки никогда не формируют трофобласт, а стволовые клетки трофобласта не дают начало эмбриональным тканям в любых условиях In vivo и In vitro.

Хотя условия среды, содействующие переключению между двумя типами кле­ток, еще не найдены, генетический переключатель, который позволяет эмбриональным стволовым клеткам про­являть потенциал стволовых клеток трофобласта в условиях культивирования стволовых клеток трофобласта, установлен. Niwa et al. (2000) получили линии эмбриональных стволовых клеток, в которых Oct4 может быть условно подавлен, и до­казали, что такие линии изменялись и не могли оставаться эмбриональные стволовые клетки даже в присут­ствии LIF, а трансформировались в клетки, похожие на гигантские клетки трофо­бласта.

Если условия культивирования эмбриональных стволовых клеток переключались на условия стволовых клеток трофобласта, происходило снижение Oct4, в результате все пролиферирующие линии клеток имели свойства стволовых клеток трофобласта. Таким образом, регуляция Oct4 на понижение является не­обходимым условием для развития трофобласта In vitro и, возможно, In vitro в бластоцисте. Ясно, что эмбриональные стволовые клетки имеют местные механизмы трофобластной дифференцировки и только нуждаются в щелчке генетического переключателя — Oct4 выкл. — и стимуляции соответствующего фактора роста, чтобы начать совершенно дру­гой путь развития.

• Формула ВКЛ Oct4 = эмбриональные стволовые клетки;
• Oct4 выключен = стволовые клетки трофобласта может быть слишком простая.

В настоящее время неизвестно, переключаются ли эмбриональные стволовые клетки на стволовые клетки трофобласта исключительно с помощью Oct4. Тем не менее, для условий культивирования In vitro это пока един­ственный известный генетический переключатель. Изменения условий микроок­ружения, в котором растут эмбриональные стволовые клетки, могут оказывать значительное действие на по­тенциал их развития.

Однако, если рестриктированные тканевые стволовые клетки экспресси­руют ключевые регуляторы транскрипции, то внеклеточных сигналов может быть недостаточно для реактивации путей. Если ключевые внутренние регуляторы бу­дут идентифицированы, их экспрессией можно управлять генетически и выявлять новые потенциалы стволовых клеток. Такая концепция комбинации генетического регулирова­ния и управления окружающей
клетки средой для выявления более полного кле­точного потенциала важна в будущем для клеточной терапии.