Эмбриональные и плюрипотентные стволовые клетки человека

После оплодотворения происходит первое деление зиготы. На этапе двух бластомеров у мышей и от 4 до 8 бластомеров у людей эмбриональный геном подвер­гается активации. У млекопитающих клетки эмбриона уплотняются и формиру­ется внешний слой трофобласта — стадия бластоцисты. Небольшая группа клеток внутри бластоцисты — внутренняя клеточная масса — дает начало всем тканям организма. На этой стадии развития стволовые клетки изолируются.
После формирования бластоцисты клетки внутренней клеточной массы плюрипотентные, но не тотигютентные. Тотипогентная клетка определяется как клетка, которая может дать рост новому организму, если обеспечить ее надлежащей материнской поддержкой. Тотипотентность клеток сохраняется у мышей только до стадии 8 бластомеров.

Плюрипотентные клетки могут дать рост всем тканям организма и многим клеткам, которые поддерживают беременность, но не могут сами воспроизвести но­вую особь. Второе важное событие в процессе дифференцировки — формирование прими­тивной эндодермы — происходит во время имплантации бластоцисты. Желточный мешок, похожий на примитивную плаценту, играет важную роль в получении и обработке питательных веществ, необходимых для развития хориоалантоисной плаценты.

В последние годы стало очевидно, что желточный мешок и другие экстраэмбриональные ткани, которые близко прилегают к плюрипотентным стволо­вым клеткам, играют ключевую роль в формировании сложных молекул, опреде­ляющих дальнейшую судьбу клеток внутри эмбриона. После имплантации эмб­риона сигналы от этих экстраэмбриональных тканей помогают определять участь клеток плюрипотентной ткани, известной как эпибластпримитивная эктодерма.
Все эти процессы приводят к постепенной потере плюрипотентности в рамках эпибласта. Исключение из правил — зародыш. Клетки зародыша, которые не под­вергаются половой дифференциации до середины беременности, сохраняют плюрипотентность до этого времени.

Так, как мало известно о молекулярной основе регуляции плюрипотентности, некоторые гены были определены как необходимые для развития плюрипотент­ных клеток. Среди них:

· факторы транскрипции Oct-4,
· фактор транскрипции Fox А3,
· новый ген «tanbe nuss».

Эмбрионы от гомозиготных мышей имеют недоста­ток в любых из этих генов и не могут обеспечить плюрипотентность клеток. В от­ношении Oct-4 известно, что правильное развитие внутренней клеточной массы в значительной степени зависит от дозы этого гена: умеренное увеличение приво­дит к дифференциации в экстраэмбриональную эндодерму, а неадекватное — в трофоэктодерму.

Происхождение эмбриональных стволовых клеток. У мышей и человека эмбриональные стволовые клетки происходят из внутренней клеточной массы бласто­цисты. Бластоцисты мышей полностью переходят в культуру, и изолированная внутренняя клеточная масса может расти сама по себе. У приматов стволовые клетки происходит из внутренней клеточной массы, изолирован­ной микрохирургическим методом.

Внутриклеточная масса эмбрионов мышей дает начало всем тканям организма, а также некоторым экстраэмбриональным тканям, включая экстраэмбриональную энтодерму, амнион и экстраэмбриональную мезодерму. Все это абсолютно плюрипотентно.

В лабораторных исследованиях Gardner (1998) показано, что именно эпибласт увеличивающейся бластоцисты дает начало эмбриональным стволовым клеткам. Хорошо известно, что мышиные эмбриональные стволовые клетки соответствуют раннему эпибласту эмбриона мышей, Плюрипотентные стволовые клетки долго не сохраняются в предимплантационном эмбрионе млекопитающих и, воз­можно, эмбриональные стволовые клетки подвергаются определенным изменениям в генной экспрессии для облегчения их бессмертного роста.

J. Thomson et al. (1998) получили эмбриональные стволовые клетки из лишних бластоцист, предоставлен­ных парами, проходящими лечение от бесплодия. Примененный ими метод не очень отличался от использованного 20 годами раннее для получения эмбриональных стволовых клеток мыши.

Иммунохирургическим методом удалялась трофоэктодерма, которая считается ингибитором становления. Внутреннюю клеточную массу помещали на слой мы­шиных эмбриональных фибробластов и вслед за коротким периодом прикрепле­ния и разрастания проводили дезагрегацию выросших клеток и помещали на дру­гой фидерный клеточный слой. При этом значительных отличий от метода полу­чения эмбриональных стволовых клеток мыши не было, и успех в получении эмбриональных стволовых клеток человека достигался с дос­таточно высокой частотой.

Другие исследователи также пытались выращивать эмбриональные стволовые клетки человека. В достиже­нии успеха сыграли роль следующие важнейшие факторы. Несомненно, помог опыт Thomson et al. с эмбриональными стволовыми клетками обезьян. Плюрипотентные стволовые клетки прима­тов по многим аспектам отличаются от эмбриональных стволовых клеток мыши, особенно по морфологии и их способности выдерживать диссоциацию на отдельные клетки. Следовательно, важ­но распознать верный тип клеток и поддерживать их соответствующим образом при субкультивировании.

Еще один фактор, на который следует обратить внима­ние — улучшение техники культивирования эмбриона человека, включая разви­тие двухстадийных систем культивирования, которые создают различную среду для соответствующих стадий развития. Это позволило получать бластоцисты хо­рошего качества с высокой частотой.

Shamblott et al. (1998) выделили плюрипотентные клетки из эмбриональных и фетальных гонад на 5- 9-й неделе после оплодотворения. Хотя немного известно о деталях созревания примордиальных половых клеток у человека, установлено, что этот период направляет стадии поступления примордиальных половых кле­ток в гонады и их пролиферацию, и происходит половая дифференциация гонад. В этот период в эмбриональных и фетальных гонадах человека обнаруживаются клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для примордиальных половых клеток.

Jorgenson et al. (1995) применили систему культивирования, включающую групповые факторы, поддерживающие выживание примордиальных половых кле­ток мыши и митоз In vitro:

· фидерный слой фибробластов,
· основной фактор роста фибробластов,
· фактор ингибирования лейкемии (LIF),
· форсколин.

В какой степени эти клетки, описанные обеими группами исследователей, со­ответствуют общим критериям эмбриональных стволовых клеток и эмбриональных половых клеток? Оба типа клеток происходят от плю­рипотентных клеточных популяций и оба поддерживают нормальный кариотии при продолжительном культивировании In vitro. Thomson et al. выращивали клет­ки в течение длительного периода и сохраняли теломеразную активность, что ука­зывает на их бессмертие. Эмбриональные половые клетки не выращивались в течение такого длительного пе­риода, но нет сведений о том, что их жизнь закончена. Полученные из бластоцис­ты клетки образуют тератомы, содержащие производные трех зародышевых лист­ков, и в некоторых случаях ткани показывают высокую степень гистологической организации, например, образование ганглиев.

Доказательства дифференцировки In vitro ограничены экспрессией маркеров, характерных для формирования трофобластов и эндодермы (продукция человеческого хорионического гонадотропина и альфафетопротеина). Неясно, представляют ли клетки, продуцирующие альфафетопротеин, экстраэмбриональную эндодерму (желточный мешок) или окон­чательно (эмбриональную эндодерму). Нет доказательств формирования тератом In vivo в отношении культур, полученных из эмбриональных половых клеток, но наблюдалась дифференци­ровка In vitro внутри эмбриоидных тел. Эмбриоидные тела — структуры, фор­мируемые плюрипотентными стволовыми клетками, растущими в трехмер­ной структуре в условиях, не позволяющих рост стволовых клеток.
У мышей эмбриоидные тела состоит из двух слоев:

· один — экстраэмбриональная эндодерма,
· другой — эктодерма.

Взаимодействие между этими двумя слоями, вероятно, уп­равляет дифференцировкой эктодермы в различные клеточные линии, что похо­же на ситуацию раннего постимплантационного эмбриона In vivo. Shamblott et а]. (1998) рассекали эмбриоидные тельца, которые спонтанно образовывались в культуре и, используя иммунохимические методы, показали экспрессию одиночных маркеров в разных типах клеток, что согласуется с таковыми маркерами клеточных линий, содержа­щихся в экто-, эндо — и мезодерме.